王 振，杨秀书，陈卫红，田 野，王晓东，储铸钢，罗光恒

（贵州省人民医院泌尿外科，贵州 贵阳 550002）

肾结石通常指结石出现于肾盏、肾盂及肾盂与输尿管之间的结石［1］。近几年，国内约5% ～15%的人群遭受该疾病的困扰，且有逐年增长的趋势［2-3］。肾结石的发病多与环境和饮食习惯等因素相关［4-5］。肾钙质沉积症会导致严重的肾损伤，血清中肌酐、尿素氮水平，尿液中的尿肌酐、尿微量白蛋白水平异常［6-7］。草酸钙晶体的沉积也会诱使NLRP3 炎症小体的激活进而诱导树突状细胞IL-1β 的分泌，最终导致肾内炎症反应［8］。炎症小体介导caspase-1 参与细胞焦亡为一种炎性细胞程序性细胞死亡，细胞焦亡能够加重肾损伤的病理损害［9-10］。

川芎嗪是川芎的生物碱类活性成分［11］。川芎嗪能通过调控NLRP3 抑制炎症因子的产生，对急性肺损伤大鼠具有保护作用［12］。NLRP3 炎症小体是分布于细胞胞浆内的蛋白复合体，包括NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 （caspase-1），能识别内外环境中刺激信号，激活caspase-1，促进白介素1β （IL-1β） 等细胞因子的分泌［13］。但川芎嗪是否能通过调控NLRP3 的激活减轻肾结石诱导的肾损伤，还未见报道。因此，本研究通过建立大鼠肾结石模型探究川芎嗪对肾结石导致的肾脏损伤的保护作用。

1 材料

1.1 试剂与药物 川芎嗪（编号DR10670），纯度≥98%，购自鼎瑞化工（上海） 有限公司。NGAL、IL-1β、IL-18 试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司； IL-1β、IL-18、NLRP3 抗体均购自英国Abcam 公司； HRP 标记的IgG 山羊抗小鼠二抗、cleaved-caspase1 抗体均购自生工生物工程（上海） 股份有限公司； DAPI 封片剂（货号40727ES10）、TUNEL 凋亡检测试剂盒（货号40307ES20）、苏木精-尹红染料（货号60502ES50） 均购自上海翊圣生物科技有限公司； β-肌动蛋白（β-actin） 抗体（批号TA-09）、DAB 显色液（批号k175914A） 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司； 尿微量白蛋白酶联免疫吸附检测 （ELISA） 试剂盒（批号GR201802-1） 购自武汉基因美生物科技有限公司。氯化铵购自上海瀚香生物科技有限公司； 乙二醇购自上海易恩化学技术有限公司。

1.2 动物 SPF 级SD 雄性大鼠24 只，体质量195～210 g，购自成都达硕实验动物有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （川） 2020-0030］。适应性喂养7 d，饲养于贵州医科大学实验动物中心，12 h/12 h 明暗交替，温度20 ～26 ℃，相对湿度40% ～70%，自由饮水进食。

2 方法

2.1 动物分组及造模 将大鼠随机分为空白组，模型组，川芎嗪低、高剂量组，每组6 只。空白组大鼠正常饲喂，每天灌胃给予蒸馏水2 mL。其余各组大鼠给予添加1.25%乙二醇的水，自由饮用，持续14 d，同时每天灌胃给予1%氯化铵2 mL 建立大鼠肾结石模型。实验第2 天起，空白组和模型组大鼠每天灌胃给予生理盐水2 mL，川芎嗪低、高剂量组大鼠每天灌胃给予50、100 mg/kg 川芎嗪，持续4周。给药结束后，收集大鼠24 h 尿液用于生化指标检测。处死大鼠收集血液以及肾脏组织用于后续各指标检测。

2.2 川芎嗪对肾结石大鼠血清、尿液生化指标影响 各组大鼠静脉取血，3 000 r/min 离心10 min，收集上清，采用半自动生化检测仪检测大鼠血清尿素、血肌酐水平。取“2.1” 项下各组大鼠24 h 尿液，采用半自动生化检测仪检测大鼠尿肌酐水平。

2.3 ELISA 法检测大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18、尿微量白蛋白的水平 取“2.1” 项下各组大鼠血液，4 ℃下放置1 h，4 ℃、3 000 r/min 离心5 min，收集上清液备用。严格按照相关试剂盒说明书操作，检测大鼠尿微量白蛋白的水平。用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度，按排列顺序依次加入50～100 μL/孔稀释好的标准液、各组大鼠血清上清液、去离子超纯水，室温或孵育30 ～60 min。采用多功能酶标仪于450 nm 波长处检测吸光度值，根据各个孔的吸光度值分析大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平。

2.4 HE 染色观察大鼠肾组织病理变化 取各组大鼠肾组织，用提前预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH 7.4） 和生理盐水冲洗。肾组织用4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE 染色。评估肾组织病理改变的严重程度，对双肾结石数目进行评分（无结石、结晶形成为1 分； 少量结石、结晶形成，每个视野3 个以下为2 分； 较多结石、结晶形成，每个视野3～5 个为3 分； 较多结石、结晶形成，每个视野6～10 个为4 分）。

2.5 TUNEL 染色检测细胞凋亡 取各组大鼠肾组织，PBS清洗，多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片，水化，脱蜡，37 ℃避光孵育30 min，使细胞膜变通透，用100 μL 1×Equilibration Buffer 固定10 ～30 min，吸出上清液用Alexa Flour 488-dUTP Labeling Mix 37 ℃孵育1 h，PBS 洗涤，用含DAPI 封片剂封闭细胞，在激光共聚焦显微镜下采集图像进行分析。

2.6 Western blot 法检测肾组织NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表达 将各组大鼠肾组织切成小块，称取相同质量，加入300 μL 蛋白裂解液，冰上超声裂解10 min，100 ℃金属浴10 min，于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，收集上清液。采用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，加入上样缓冲液后加热变性，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，湿法将蛋白转膜，室温下用5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，与兔抗鼠NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18、β-actin 一抗稀释液在4 ℃下孵育过夜，TBST 清洗4 次，与山羊抗兔IgGHRP 二抗稀释液室温孵育1 h，TBST 清洗4 次，ECL 显色，定影，将胶片进行扫描，通过Image J 图像分析软件分析条带灰度值，以β-actin 为内参，计算目的蛋白相对表达。

2.7 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 川芎嗪对肾结石大鼠肾功能和炎症水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中尿素、肌酐及尿液中24 h 尿蛋白水平升高（P＜0.01），尿肌酐水平降低（P＜0.01），血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，川芎嗪各剂量组大鼠24 h 尿蛋白水平降低（P＜0.05，P＜0.01），川芎嗪高剂量组大鼠血清肌酐水平降低（P＜0.01），尿肌酐水平升高（P＜0.01），血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平降低（P＜0.05），见图1。

图1 川芎嗪对肾结石大鼠肾功能和炎症水平的影响（±s，n＝6）

3.2 川芎嗪对肾结石大鼠肾脏病理的影响 空白组大鼠肾脏组织被膜较为完整，未见变性、坏死和脱落，未见明显病理改变； 模型组大鼠出现部分肾小管有所扩张，伴随上皮细胞扁平化，部分肾皮质和髓质肾小管管腔内见不着色、带折光性的透明结晶沉积，亦可见细胞管型，肾小管变性坏死区域间质内见少量纤维组织增生，以核呈长梭形的纤维细胞增生为主，部分伴有少量炎细胞浸润； 川芎嗪各剂量组大鼠部分肾皮质和髓质肾小管管腔内见透明结晶沉积，肾小管变性坏死区域间质内见少量纤维组织增生，提示川芎嗪能改善大鼠肾组织的病变，见图2A。与空白组比较，模型组大鼠肾结石评分升高（P＜0.01）； 与模型组比较，川芎嗪各剂量组大鼠肾结石评分降低（P＜0.01），见图2B。与空白组比较，模型组大鼠肾组织细胞凋亡率升高（P＜0.01），肾组织凋亡阳性细胞增加； 与模型组比较，川芎嗪各剂量组大鼠肾组织细胞凋亡率降低（P＜0.01），氯化铵晶体结石造成的肾脏细胞凋亡现象则几乎消失，提示川芎嗪能够减弱结石造成的细胞凋亡，见图2C～2D。

图2 川芎嗪对肾结石大鼠肾脏病理的影响（±s，n＝6）

3.3 川芎嗪对肾结石大鼠肾组织 NLRP3、cleavedcaspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肾组织NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，川芎嗪各剂量组大鼠肾组织IL-18 蛋白表达降低（P＜0.05），川芎嗪高剂量组大鼠肾组织NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），见图3。

图3 川芎嗪对肾结石大鼠肾组织NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表达的影响（±s，n＝6）

4 讨论

肾结石是泌尿系统常见的疾病，其中泌尿系结石能够引起尿路损伤和感染甚至泌尿系的梗阻，治疗不及时或长期的存在，还会影响肾脏功能，增加泌尿系肿瘤的发生概率［14］。肾结石通常也会伴随肾损伤、肾功能异常等其他常见并发症［15］。因此，寻找新的药物对肾结石造成的肾损伤进行修复能有效改善患者的生活质量，降低肾结石的治疗成本。本研究利用氯化铵建立肾结石大鼠模型，并探究川芎嗪对肾脏NLRP3 炎症小体的抑制作用以及对肾脏功能的改善作用。结果表明，肾结石大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平升高，血清肌酐、尿素和尿肌酐、24 h 尿蛋白水平出现异常，表明肾结石大鼠出现肾功能异常。川芎嗪可降低肾结石大鼠血清肌酐和尿素氮水平，同时也能抑制炎症因子IL-1β、IL-18 的产生，提示其能缓解肾结石造成的肾损伤并减弱肾结石造成的炎症反应，发挥肾脏的保护作用。

炎症反应是肾脏损伤的重要因素，NLRP3 是炎症反应的关键启动因子［16-18］。研究发现，NLRP3 炎症小体在各类肾病所导致的肾损伤过程中发挥着极为重要的作用。NLRP3 炎症小体能通过诱导caspase-1 活化，促使IL-1β、IL-18 的产生，使机体产生炎症反应。肾结石造成的肾功能异常会出现NLRP3 炎症小体的激活，导致肾脏炎症反应的发生，影响肾脏的功能［8］。本研究发现，川芎嗪可降低肾结石大鼠肾脏IL-1β、TNF-α 水平，同时减弱cleavedcaspase1 蛋白表达，提示川芎嗪可抑制肾结石诱导的NLRP3 炎症小体的活化，从而抑制炎症因子水平，起到保护肾脏的作用。本研究初步探讨川芎嗪对肾结石大鼠的保护作用，对于其作用机制还需要进一步研究。