李 梅，王 丽，夏亚飞，阎 姝*

（1.天津大学，天津 300100； 2.河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011； 3.天津市第二人民医院，天津 300192； 4.天津大学中西医结合医院，天津 300100； 5.天津市南开医院，天津 300100）

病毒性肺炎是感染呼吸道病毒引起的肺部炎症，是威胁人类健康的主要疾病之一。通常情况下，病毒性肺炎症状轻微且具有自限性，但重症也可引起脓毒血症、高碳酸血症、低氧血症、急性呼吸衰竭、循环系统衰竭，甚至危及生命［1］。尤其是高传染性、致死率的病毒性肺炎，如果防控不及时，会造成重大的公共卫生事件，对社会和经济运行造成长期、持续的负面影响。2019 年，新型冠状病毒（COVID-19） 来势凶猛，迅速蔓延，全球流行，对全球的生产、生活产生了巨大影响［2］。因此寻找具有抗病毒性肺炎作用的药物具有积极作用。

现代研究表明，甘草酸制剂作为传统的抗炎、保肝药，联合应用能够减少重症肺炎的渗出，降低各项肝功能指标和炎症指标，患者病程缩短，住院时间减少［3-4］。有研究报道称，复方甘草酸苷可以抑制传染性非典型肺炎（SARS）病毒的复制，发挥非特异性抗炎作用，且副作用较少［5］。但复方甘草酸苷抗肺炎病毒的作用机制尚不十分明确，本研究以病毒性肺炎小鼠为研究对象，探讨复方甘草酸苷对病毒性肺炎小鼠肺损伤的保护作用，初步探究其作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级成年雄性C57BL/6 小鼠，体质量（20 ±2） g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2019-0008］，在安静环境下适应性饲养1 周，相对湿度55% ～60%，给予充足清洁饮水，自由摄食。实验经动物伦理委员会审查通过（伦理号2021-SYDWLL-000038）。

1.2 试剂与药物 复方甘草酸苷（日本米诺发源制药株式会社，批号H20181051）。POLY （I： C） （上海源叶生物科技有限公司，批号S18188）； 地塞米松注射液（辰欣药业股份有限公司，批号H37021967）； 小鼠IL-10、IL-6、IL-4 ELISA 试剂盒 （上海酶联生物科技有限公司，货号ml037873、ml063159、ml063156）； 小鼠 IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒 （上海蓝基生物科技有限公司，货号E02I0010、E02T0008）； 兔抗小鼠NF-κB p65、Akt、p-Akt、β-actin 抗体 （美国Proteintech 公司，货号10745-1-AP、60203-2-Ig、66444-1-Ig、20536-1-AP）； 兔抗小鼠p-NF-κB p65 抗体（美国CST 公司，货号3033）； 兔抗小鼠PI3、p-PI3 激酶抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-10657R、bs-6417R）； BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号PC0020）。

1.3 仪器 Sorvall ST 16R 型高性能通用台式冷冻离心机、多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； Nikon ECLIPSE TS100 型光学显微镜（日本Nikon 公司）； 电泳仪、电泳槽、转印槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；摇床（天津欧诺仪器股份有限公司）。

2 方法

2.1 病毒性肺炎小鼠模型的建立 将造模小鼠用异氟烷麻醉后，仰卧位固定于60°倾斜的鼠板上，置于超净台中，保持头部高、尾部低。充分暴露小鼠颈部并进行消毒，逐层暴露气管，用1 mL 注射器抽吸药液，左手稍微固定气管，针头向心方向斜行刺入气管，出现落空感之后，稍微平行向前伸入部分针头，回抽无阻力并有空气。向内缓慢滴注POLY （I： C） 5 mg/kg （溶于50 μL PBS 中），滴注完成后注入少量空气，使全部药液进入气管后立即竖起木板，左右轻柔摇动使药液均匀分布在肺内。麻醉作用消退后，小鼠恢复自主呼吸并处于清醒状态后，放回鼠笼中，即造模完成。

2.2 分组及给药 小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和复方甘草酸苷低、高剂量组，每组10 只。除正常组外，其余组均制备病毒性肺炎小鼠模型。造模成功后，正常组、模型组小鼠腹腔注射0.5 mL 生理盐水，每12 h 注射1 次，共给药2 次。阳性药物组腹腔注射地塞米松注射液5 mg/kg，共给药1 次； 复方甘草酸苷低、高剂量组分别腹腔注射复方甘草酸苷26、52 mg/kg （临床等效剂量的1、2 倍），每12 h 注射1 次，共给药2 次。

2.3 肺泡灌洗液（BALF） 采集 造模及给药24 h 后，暴露小鼠胸腔，逐层暴露颈部气管，在小鼠气管上做“一”字型切口，将小鼠灌胃针插入右主支气管下端，通过手术缝合线对气管和小鼠灌胃针进行结扎。将小鼠左肺门使用手术缝合线结扎牢固，确保左肺处于密闭状态。使用注射器抽取1 mL 生理盐水，与结扎在颈部气管的灌胃针头连接，将生理盐水缓缓注入小鼠右肺，生理盐水在肺泡内停留15～30 s 后轻柔回吸BALF，灌洗过程中密切观察生理盐水有无渗出。反复抽注3 次，每只小鼠共回收约2.5 mL BALF。

2.4 肺湿/干重比检测 收集各组小鼠BALF 后，留取未被灌洗的小鼠左肺，称量左肺湿重，随即置于恒温箱内80 ℃烘干48 h，至肺组织质量不再减少后，再次称重，为干重，计算肺湿/干重比，衡量肺水肿严重程度。

2.5 BALF 总细胞数及总蛋白水平检测 运用细胞计数板计数BALF 总细胞数，然后将BALF 于4 ℃、3 000 r/min 条件下离心10 min，留取上清液，使用总蛋白测定试剂盒检测BALF 总蛋白水平。

2.6 HE 染色观察小鼠肺组织病理学改变 收集各组小鼠肺组织，用福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成3 μm 切片，HE 染色，中性树胶封片，于光学显微镜下观察各组小鼠肺组织病理学改变，评价肺损伤程度。

2.7 ELISA 法检测BALF 中炎症因子水平 将实验中收集的BALF 于4 ℃、3 000 r/min 条件下离心10 min，用相应的ELISA 试剂盒检测BALF 炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 水平，具体操作严格根据试剂盒说明书进行。

2.8 肺组织匀浆液中SOD、GSH-Px 活性与MDA 水平检测 肺组织匀浆后使用BCA 试剂盒进行蛋白定量，将各组肺组织中蛋白水平进行均一化处理，按照试剂盒说明书检测肺组织匀浆液中SOD、GSH-Px 活性与MDA 水平。

2.9 Western blot 检测肺组织PI3K、Akt、NF-κB p65 蛋白表达 取小鼠肺组织，使用裂解液裂解组织，离心，留取上清。BCA 法测定总蛋白浓度，蛋白变性后取30 μg 样品进行电泳、转膜、封闭，加入一抗NF-κB p65 （1 ∶1 000）、p-NF-κB p65 （1 ∶ 1 000）、PI3K （1 ∶ 1 000）、p-PI3K（1 ∶1 000）、Akt （1 ∶5 000）、p-Akt （1 ∶5 000）、β-actin（1 ∶4 000），4 ℃孵育过夜，次日洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，洗膜后ECL 发光显色，通过凝胶图像分析仪成像，采用Image J 软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达。

2.10 统计学分析 通过SPSS Statistics 20.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 复方甘草酸苷对病毒性肺炎小鼠肺损伤的影响 如图1 所示，与正常组比较，模型组小鼠肺湿/干重比值和BALF 中总细胞数、总蛋白水平均升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和复方甘草酸苷高剂量组小鼠肺湿/干重比值和BALF 中总细胞数、总蛋白水平均降低（P＜0.01），复方甘草酸苷低剂量组小鼠BALF 中总细胞数、总蛋白水平降低（P＜0.05）。

图1 各组小鼠肺湿干/重比值（A） 和BALF 中总细胞计数（B）、总蛋白水平（C） 变化（±s，n＝10）

如图2 所示，正常组小鼠肺泡间隔正常，肺间质无水肿，无明显炎性细胞渗出； 模型组肺泡结构严重破坏，肺泡腔融合，肺泡间隔增宽，塌陷，间质水肿，以及大量炎性细胞浸润； 阳性药组和复方甘草酸苷各剂量组肺泡结构较为清晰，肺泡壁稍增厚，伴少量炎性细胞浸润。

图2 各组小鼠肺组织HE 染色

3.2 复方甘草酸苷对病毒性肺炎小鼠肺组织炎症反应的影响 如图3 所示，与正常组比较，模型组小鼠BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平升高（P＜0.01），IL-4 和IL-10 水平无明显变化（P＞0.05）； 与模型组比较，阳性药组和复方甘草酸苷各剂量组小鼠BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），阳性药组和复方甘草酸苷高剂量组小鼠BALF 中IL-4 和IL-10 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 各组小鼠BALF 中炎症因子水平（±s，n＝10）

3.3 甘草酸苷对病毒性肺炎小鼠肺组织氧化应激水平的影响 如表1 所示，与正常组比较，模型组小鼠肺组织SOD、GSH-Px 活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和复方甘草酸苷高剂量组小鼠肺组织SOD、GSH-Px 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA水平降低（P＜0.01），复方甘草酸苷低剂量组小鼠肺组织GSH-Px 活性升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05）。

表1 各组小鼠肺组织氧化应激相关因子水平比较（±s，n＝10）

表1 各组小鼠肺组织氧化应激相关因子水平比较（±s，n＝10）

注： 与正常组比较，＃＃P＜0.01； 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别SOD/（U·mg prot-1）GSH-Px/（U·mg prot-1）MDA/（nmol·mg prot-1）正常组54.95±10.621.25±3.261.80±0.35模型组28.05±13.19＃＃8.56±4.77＃＃3.97±1.50＃＃阳性药组40.12±11.99*15.59±5.72**2.41±0.47**复方甘草酸苷低剂量组32.04±7.1912.74±3.41*2.80±0.70*复方甘草酸苷高剂量组40.04±4.83*15.47±3.86**2.50±0.44**

3.4 甘草酸苷对病毒性肺炎小鼠肺组织PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达的影响 如图4 所示，与正常组比较，模型组小鼠肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-p65/p65 蛋白表达比值升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和复方甘草酸苷各剂量组小鼠肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-p65/p65 蛋白表达比值降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 各组小鼠肺组织PI3K/Akt/NF-κB 通路相关蛋白表达（±s，n＝10）

4 讨论

病毒性肺炎是由病毒经呼吸道浸入肺上皮细胞引起的肺间质实质性炎症，其发病机制多与炎症风暴、氧化应激有关［6-7］。POLY （I： C） 是一种合成的双链核糖核酸，能够模拟病毒感染的免疫激活机制，经常用于病毒性肺炎模型的建立［8-9］。本研究通过向气管内缓慢滴注POLY （I：C） 构建病毒性肺炎小鼠模型，发现小鼠肺泡结构严重破坏，肺泡腔融合，肺泡间隔增宽，塌陷，间质水肿，大量炎性细胞浸润，炎症因子水平升高，提示模型构建成功。

复方甘草酸苷是由甘草酸苷、甘氨酸和盐酸半胱氨酸等成分组成的复方制剂，每1 mL 中含甘草酸苷2 mg。现代研究表明，复方甘草酸苷能够通过抑制花生四烯酸的代谢，抑制炎症反应，缓解大鼠肺损伤，延缓新型冠状病毒的扩散［10-11］。本实验结果显示，复方甘草酸苷干预后，小鼠肺泡结构清晰，肺泡壁稍增厚，伴少量炎性浸润，提示复方甘草酸苷对病毒性肺炎肺损伤具有改善作用。

炎症细胞聚集是病毒性肺炎的重要发病机制，大量的炎性细胞释放炎性细胞因子和趋化因子，使肺内皮细胞活化，白细胞迁移、增殖，巨噬细胞、中性粒细胞分泌，募集更多炎性因子，造成过度炎症，加重组织、器官的损坏［12-13］。现代研究表明，甘草提取物及甘草酸均可通过抑制NF-κB 的活性，抑制急性肺损伤小鼠炎症因子的表达，发挥抗炎作用［14-15］。本实验结果显示，复方甘草酸苷能降低BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，提示复方甘草酸苷能够抑制炎症因子的分泌，发挥抗炎作用。

氧化应激反应是病毒性肺炎的另一重要机制。病毒感染的过程中，大量的中性粒细胞聚集在炎症部位，激活活性氧（ROS），而过量的ROS 使炎性复合体中的蛋白损伤，炎性复合体活性下降会导致免疫系统失衡，加重组织损伤［16］。有研究报道，甘草酸及其单铵盐均可增加SOD、GSH-Px 活性，降低MDA 水平［17-18］。本实验结果显示，复方甘草酸苷可上调肺组织中SOD、GSH-Px 活性，降低MDA水平，表明其具有抗氧化应激作用。

PI3K 信号通路参与细胞的增殖、分化等多种生物功能。Akt 是PI3K 的主要下游效应分子，活化的Akt 通过增强IκB 激酶的降解，使NF-κB 活化，活化的NF-κB 诱导炎症因子、趋化因子的表达，使大量的炎性细胞浸润、聚集在炎症部位，加速炎症的发生、发展［19-20］。现代研究表明，甘草酸可以通过抑制花生四烯酸、NF-κB、PI3K 等多种代谢产物，使炎性递质（PGE2、PIG2、TXA2） 的释放减弱，发挥抗炎作用［21］。本实验结果显示，复方甘草酸苷干预后，小鼠肺组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-p65/p65 比值下降，表明复方甘草酸苷能够抑制PI3K/Akt/NF-κB 信号通路相关蛋白的表达，起到保护肺损伤作用。

综上所述，复方甘草酸苷能够改善病毒性肺炎小鼠肺组织损伤，减轻炎性反应和氧化应激水平，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/NF-κB 通路活化有关。