姚 晨，赵庆林，张生潭，贾睿琦，黄东杰，宋忠强，韩 旭，武红娜*

（1.沧州市食品药品检验所，河北 沧州 061000； 2.河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061000）

腰息痛胶囊为中西药复方制剂，由白芷、独活、三七、威灵仙等22 味中药和对乙酰氨基酚组成，具有舒筋通络、散寒除湿、补肾益肝等功效［1-2］，方中独活指标成分为蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯，三七指标成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1，共为臣药，具有活血散淤、舒筋活络的作用； 威灵仙指标成分齐墩果酸具有祛风除湿、通络止痛功效，也与该制剂功能主治相吻合［3-8］。目前，腰息痛胶囊标准中只有理化鉴别、常规检查项、对乙酰氨基酚含量测定，相关研究也大多是围绕欧前胡素、对乙酰氨基酚，鲜有涉及其他成分［9-10］，亟待修订和提高以更全面控制该制剂质量，为其临床应用提供技术支撑。

中成药所含成分复杂多样，为了全面控制其有效性和安全性，一测多评法正成为相关质量控制的研究热点和发展趋势［11］，它是以内标法对1 种指标成分定量后实现对其他指标成分定量的方法［12-14］，检测成本低，可较全面地反映制剂内在质量。因此，本实验建立该方法同时测定腰息痛胶囊中三七皂苷R1、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、齐墩果酸的含量，以期为该制剂质量控制及其质量标准修订提供技术支撑。

1 材料

1.1 仪器 LC-2040C 3D 型高效液相色谱仪、LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）； CP225D 型电子天平（德国赛多利斯公司）； LC350A 型超声波处理器（山东济宁鲁超超声设备有限公司）； Advantage A10 型超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 三七皂苷R1（批号110745-201921，纯度90.4%）、二氢欧山芹醇当归酸酯（批号111583-202006，纯度98.9%）、人参皂苷Rb1（批号110704-202230，纯度95.1%）、人参皂苷 Rg1（ 批号 110703-202235，纯度98.5%）、蛇床子素（批号110822-202111，纯度99.7%）、齐墩果酸（批号110709-202109，纯度95.8%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯（德国默克公司）； 正丁醇、磷酸为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）； 水为超纯水（自制）。腰息痛胶囊共10 批，具体见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Venusil MP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -水（B），梯度洗脱，程序见表2； 体积流量0.8 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长203 nm；进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品适量，甲醇制成分别含三七皂苷R10.202 4 mg/mL、二氢欧山芹醇当归酸酯0.086 41 mg/mL、蛇床子素0.102 1 mg/mL、人参皂苷Rb10.207 4 mg/mL、人参皂苷Rg10.202 2 mg/mL、齐墩果酸0.063 51 mg/mL 的溶液，摇匀，滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品内容物约2 g，精密称定，精密加入50 mL 甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方工艺，分别制成缺三七、缺独活、缺威灵仙的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密量取“2.2” 项下对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中各成分色谱峰的出峰时间、顺序与对照品溶液中的一致，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.3.2 线性关系考察 精密称取各对照品适量，甲醇制成系列质量浓度，在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得三七皂苷R1、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、齐墩果酸峰面积 RSD 分别为0.6%、1.3%、1.1%、1.8%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份本品（批号211108） 适量，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得三七皂苷R1、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、齐墩果酸峰面积RSD分别为0.9%、0.8%、1.4%、1.1%、1.2%、1.5%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取供试品溶液（批号211108） 6 份，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得三七皂苷R1、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、齐墩果酸峰含量RSD 分别为0.7%、1.2%、0.9%、1.4%、1.1%、1.6%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品（批号211108） 6 份，每份约1 g，加入等量对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，三七皂苷R1、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、齐墩果酸平均加样回收率分别为97.8% （RSD ＝0.8%）、98.7%（RSD ＝1.4%）、99.1% （RSD ＝0.7%）、99.8% （RSD ＝1.1%）、98.6% （RSD ＝0.9%）、99.3% （RSD ＝1.2%）。

2.3.7 相对校正因子计算 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以人参皂苷Rg1为内标，计算其他5 种成分的相对校正因子fk/s，公式［16-17］为fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） / （CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表4。

表4 各成分相对校正因子

2.4 耐用性考察

2.4.1 仪器、色谱柱 取对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，考察LC-2040C 3D、LC-30A 色谱仪及Venusil MP C18、Diamonsil C18、Thermo C18色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表5 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响

2.4.2 色谱峰定位 本实验采用相对保留时间法测定各成分在“2.4.1” 项仪器、色谱柱下的相对保留值ri/s，公式为ri/s＝tRi/tRs，结果见表6，可知均无明显影响 （RSD＜2.0%）。

表6 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响

2.5 样品含量测定 精密称取10 批样品，每批3 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表7，可知2 种方法所得结果接近 ［相对误差（RE） ＜1%］。

表7 各成分含量测定结果（μg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 内标成分选择 现代药理研究表明，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等成分具有散瘀止血、消肿定痛、抗炎抗菌等作用［15-16］，与腰息痛胶囊功能主治相符。其中，三七皂苷R1出峰位置位于上述6 种成分的第3 位，结合该成分色谱峰峰面积、含量、价格、易得程度等因素，本实验以其为内标。

3.2 提取溶剂选择 本实验考察了50% 甲醇、甲醇（含2%磷酸）、甲醇、水饱和正丁醇、70% 乙醇对各成分提取能力的影响，发现三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以水饱和正丁醇、甲醇提取时较完全，并且齐墩果酸以甲醇提取时溶解性较好，考虑到操作简便性，最终以甲醇为提取溶剂。

4 结论

目前，关于一测多评法的报道大多为单一药味中单一种类成分的含量测定［17-21］，而本实验所建立的方法可同时测定腰息痛胶囊中三七皂苷R1、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、齐墩果酸的含量，并且其重复性、精密度、耐用性良好，检测结果与外标法一致，同时在拥有部分成分对照品的情况下能排除其他成分的干扰，不仅降低了成本，还具有准确、灵敏、快速的优点，为该制剂的质量评价提供了技术支撑，也为其他中西药复方制剂质量标准的修订提供了参考。