甘草西定的药理学研究进展

2023-11-23马汉伟白银亮张有成

中成药 2023年11期

马汉伟，张明，白银亮*，张有成

（1.兰州大学第二医院小儿消化科，甘肃兰州 730030； 2.兰州大学第二医院药剂科，甘肃兰州 730030；3.兰州大学第二医院普外科，甘肃兰州 730030）

甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎［1］。迄今为止，从甘草中分离出的化合物已达四百余个，药理研究也证实甘草属的不同提取物以及分离的次生代谢产物具有多种生物学活性［2-4］。甘草西定是甘草的活性成分之一，1968 年由日本学者首次从甘草的根部提取并鉴定［5］，随后其多种生物学作用被相继报道，特别在抗菌、治疗口腔疾病、抗肿瘤等方面疗效显著。甘草西定是一种白色针状结晶，在二氯甲烷中的熔点为161～162.5 ℃，CAS 编号30508-27-1，分子式C26H32O5，化学结构3＇，6-双异戊烯基-2＇，4＇，7-三羟基-5-甲氧基异黄烷（图1）［5］。异戊烯基的存在会增加黄酮类化合物的亲脂性，增强其对生物膜的亲和力和对靶蛋白的结合力［6-7］，这也可能是甘草西定具有广泛药理作用的结构基础。本文将对甘草西定的现代药理学研究进展进行综述，探讨其研究方向和应用前景，为该化合物今后成为新药研发的有效候选分子提供理论依据。

图1 甘草西定结构式

1 提取方法

目前甘草西定的提取方法主要是利用有机溶剂进行的，但由于异戊烯基黄酮类化合物在甘草中的含量极低（＜100 μg/g）［8］，提取效率并不理想。近年来倡导的绿色溶剂具有良好的热稳定性、不挥发性、不燃性，以及能够更好地溶解细胞壁纤维素和释放目标分子等特性［9-10］。Ji 等［11］设计的疏水性离子液体［C8MIM］ BF4 （1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐），能够与甘草西定产生很强的相互作用，同时［C8MIM］ BF4 可再循环利用，这使得甘草西定的提取效率明显提高，为今后批量提取提供了先进的技术保障。

2 药动学研究

王牧原［12］首次建立HPLC 法测定血浆中的甘草西定，当其血药浓度在0.1 ～10 μg/mL 时，与峰面积的线性关系良好，回收率高，重复性好，甘草西定的标准贮备液和生物样品在不同温度条件下长期保存时药效稳定。在平行人工膜透性试验（PAMPA）中，当pH 为4.0、7.4 时，甘草西定对PAMPA 的通透性均中等，提示甘草西定可能在胃和小肠中吸收［13］。肝微粒体对甘草西定的代谢具有显著的物种差异，人类的代谢能力低于大鼠、小型猪、兔、狗、猴等物种［13］。Wang 等［14］给予大鼠甘草西定灌胃后，仅在粪便中检测到1 种甘草西定的单羟基化衍生物，并认为此羟基化反应可能发生在异戊烯基的反式甲基上。CYP 亚型（ CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4）参与了甘草西定的代谢，可通过氢键和π-π 堆积发生相互作用［13］。甘草西定也可被UGT1A9 选择性代谢，产生7-葡糖醛酸甘草西定［15］。因此，水化和羟基化是甘草西定的主要生物转化方式，葡萄糖醛酸化也是清除甘草西定的重要途径。另有研究发现，当甘草西定浓度为10 μmol/L 时，对CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19 的抑制率超过50%［16］；浓度为100 μmol/L 时，对CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4 的抑制率超过 90%，对 UGT1A3、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A9、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B15则能够完全抑制［13］，这些发现将有助于为接受甘草西定治疗的患者提供更合理的临床用药指导。

3 药理作用

甘草西定最初是研究者在寻找具有抗胃溃疡的活性成分时，从光果甘草的根部提取并鉴定的化合物［5］。随着研究的深入，该化合物的多种药理学活性被逐渐报道，涉及抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多个方面。

3.1 抗菌因黄酮类化合物具有较强的抗菌活性，故有“植物抗菌素” 之称。研究发现，黄酮类化合物特定位置的某些官能团（如烷基链、烷基氨基链、异戊二烯基、含有氧或氮的杂环单元等疏水取代基）的存在会增加化合物的亲脂性，环A 和B 上不同位置的OH 基团的存在则增加了抗菌活性［17-19］。因此，甘草西定的抗菌活性可能与其同时具有多个异戊烯基和羟基的特殊结构有关。详见表1。

表1 甘草西定的抗菌活性

3.1.1 常见耐药菌抗生素的使用虽然在很大程度上降低了感染性疾病的发病率和严重程度，但随之出现的细菌耐药问题给临床诊疗带来了新的挑战，其中以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药肠球菌（VRE）最为常见。研究显示，8 μg/mL 甘草西定与苯唑西林联用时，可使苯唑西林对MRSA 的最低抑菌浓度（MIC）降至0.5 μg/mL 以下，而PBP2＇的形成并未受影响，提示甘草西定可能通过修复苯唑西林的抗菌活性而降低其耐药性［20-21］。另有研究发现，甘草西定对VRE 菌株的抗菌作用显著，MIC 为1.9×10-5mol/L［22］。因此，利用结构特点，优化甘草西定与抗生素的联合用药方案，可能为今后耐药菌的治疗提供新的思路。

3.1.2 口腔致病菌变形链球菌是龋齿形成的主要病原体，可通过分解膳食中的碳水化合物而产生有机酸，导致牙齿钙化组织的局部溶解和破坏。甘草西定能够有效抑制变形链球菌（MIC 为6.25 ～12.5 μg/mL）［26-28］，减少酸性物质的产生，降低其黏附性，且对口腔胶质细胞的形成几乎没有毒性［28］。牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧球杆菌，是促发慢性牙周炎的关键病原体。该细菌通过破坏宿主免疫稳态诱导炎症反应，导致牙龈组织破坏和牙齿周围的牙槽骨进行性丧失［32-33］。甘草西定除了能够抑制牙龈卟啉单胞菌生长［27-34］外，还可抑制NF-κB p65 的磷酸化，减少白细胞介素-6 （IL-6）、趋化因子配体5 （CCL5）、基质金属蛋白酶（MMP） -7/8/9 等的分泌［35］。粪肠球菌感染后会在牙本质、牙胶、羟基磷灰石和骨等不同基质上形成致密的生物膜，对抗菌药物具有高度耐药性，是牙髓治疗失败的主要原因［36］。Marcoux 等［26］发现，甘草西定对粪肠球菌等牙根管病原体的杀菌作用与氯已定相当，并且对牙龈成纤维细胞不产生细胞毒性。若甘草西定与乳链菌肽联合，则对粪肠球菌具有协同杀菌作用，还能够抑制粪肠球菌诱导NF-κB 信号通路的活化，阻断炎性因子的释放，从而达到根管消毒的目的［25］。Tanabe 等［29］在唾液模型中发现，甘草西定能够显著抑制莫雷梭菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌等细菌的生长，减少挥发性硫化合物（VSCs）的生成，从而有效缓解口臭。此外，甘草西定对牙髓卟啉单胞菌、衣氏放线菌、具核梭杆菌、远缘链球菌等口腔常见致病菌也表现出良好的抗菌活性［26-34］。因此，甘草西定可用于研发新型的口腔消毒药品及口腔保健食品的添加剂。

3.1.3 幽门螺杆菌根除幽门螺杆菌（Hp）是治疗消化性溃疡的重要措施之一，但目前Hp 耐药的形势日益严峻，治疗难度增加。体外研究显示，甘草西定对4 种Hp 菌株的抗菌作用显著，特别是对阿莫西林和克拉霉素的耐药菌GP98，MIC 为6.25～12.5 μg/mL［30］，这也间接解释了甘草西定能够治疗胃溃疡［5］的原因。

除此之外，甘草西定对化脓性链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等上呼吸道病原菌以及枯草芽孢杆菌、藤黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌等的抗菌作用显著［23-31］，这些研究将为今后感染性疾病的治疗提供重要依据。

3.2 抗肿瘤据统计，自20 世纪40 年代以来，约53.4%的小分子抗肿瘤药物来源于天然药物或天然药物的半合成品［37］，以药用植物为代表的天然药物在肿瘤的防治方面正发挥着越来越重要的作用。

3.2.1 肿瘤的预防N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）是一种DNA 烷基化致癌物。Inami 等［38］利用TA1535 鼠伤寒沙门氏菌研究了甘草西定对MNU 的抗诱变活性，证实该化合物可通过抑制MNU 造成的DNA 损伤来发挥化学预防癌症的作用。

3.2.2 肿瘤的治疗 2010 年韩国学者研究首次报道了甘草西定的抗癌作用。该研究首先发现一种乌拉尔甘草的己烷乙醇提取物，命名为“HEGU”，对表皮生长因子（EGF）诱导的DU145 细胞具有抗转移作用，经提取和鉴定后证实“HEGU” 的活性成分是甘草西定。与对照组比较，甘草西定能够抑制癌细胞迁移，降低MMP-9、尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）、血管内皮生长因子（VEGF）表达，减少黏附分子的分泌［39］。随后该团队又建立了小鼠乳腺癌4T1细胞动物模型，给予甘草西定腹腔注射21 d。结果显示，给药组小鼠肿瘤组织内的血红蛋白表达降低，转移性肺结节数量减少，肺质量减轻。进一步探讨机制后发现，甘草西定可通过减少癌细胞迁移、抑制血管生成及淋巴管生成来抑制肺转移。该研究还发现，甘草西定能够抑制CD45、F4/80、CD206 等M2 巨噬细胞标记蛋白的表达，降低HIF-1α、iNOS、COX-2 等炎症相关蛋白表达，从改善肿瘤微环境的角度阐明了其抗肿瘤作用［40］。

Cevik 等［41］探讨了多种甘草根部提取物对肿瘤细胞的细胞毒性，其中以甘草西定对肝细胞癌Huh7 细胞的抑制作用最强，IC50为4.7 μmol/L，能够抑制肝癌细胞增殖、促进凋亡，阻滞细胞周期于SubG1期（提示凋亡细胞死亡）、G1期和G2/M 期，但具体的作用机制尚不明确。Ji 等［42］通过体内外实验发现，甘草西定能够有效抑制结直肠腺癌细胞SW480 增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和自噬。利用AMPK 显性负性突变体，使甘草西定的上述抗肿瘤作用成功逆转，从而证实甘草西定可通过活化AMPK 以诱导癌细胞发生凋亡和自噬。课题组在甘草西定能够治疗胃溃疡、抑制Hp 的研究基础上，通过体内和体外实验证实了甘草西定的抗胃癌作用，其机制为抑制MGC-803 胃癌细胞增殖、促进凋亡，将细胞周期阻滞于G0/G1期，减弱癌细胞的侵袭和迁移能力，并利用定量蛋白质组学、生物信息学及分子对接等技术，筛选出可能的药物作用靶点，最终阐明甘草西定可能通过阻断ICMT/Ras 信号通路发挥抗胃癌活性［43］。

吉西他滨是一种阿糖胞苷类似物，尽管它在动物实验中表现出良好抗肿瘤作用，但在临床上单药的抗肿瘤疗效并不理想，这可能与耐药有关。Wang 等［44］发现，吉西他滨和甘草西定均能抑制骨肉瘤细胞株U2OS 和MG-63 增殖，促进caspase-3 蛋白表达。两者联合用药后，甘草西定可增强吉西他滨的细胞毒性，并通过抑制Akt 和NF-κB 通路来协同吉西他滨发挥抗肿瘤作用。详见表2。

表2 甘草西定的抗肿瘤活性及其相关靶标

总之，目前的研究已证实甘草西定对多种肿瘤细胞的生物学行为具有较强的抗肿瘤活性，但未来亟需开展抗肿瘤治疗靶点及机制方面的研究，以期为新型抗肿瘤药物或联合用药方案提供依据。

3.3 抗炎、调节免疫早在1991 年日本学者就观察到甘草西定能够抑制3＇，5＇-环磷酸腺苷（cAMP）磷酸二酯酶［45］，发挥抗血小板聚集的作用，这为甘草西定后续的抗炎作用研究奠定了基础。血小板活化因子（PAF）是一种介导炎症、过敏、内毒素性休克等反应的磷脂媒介，炎症细胞在受到适当刺激后可产生。乙酰辅酶A 乙酰基转移酶（LPAFAT）是细胞内合成PAF 的关键酶［46］。体外研究显示，甘草西定能抑制LPAFAT 活性，阻断PAF 的生成，起到抗炎、抗过敏的作用［47］。

Lck 去磷酸化则是T 细胞活化的初始步骤，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1 型（PTPN1），又称酪氨酸蛋白磷酸酶1B（PTP1B），则在T 细胞的活化中起关键作用。Lee 等［48］发现，甘草西定能够抑制由活化T 细胞产生的IL-2，但对T细胞无细胞毒性作用。在体外实验中，甘草西定通过调节PTPN1 活性来抑制Lck 的去磷酸化。在二硝基氯苯/屋尘螨提取物诱导特应性皮炎的动物模型中，经甘草西定治疗的小鼠相关症状明显改善，并且耳组织中炎性细胞因子的水平也降低。因此认为甘草西定具有抗炎、调节免疫的作用，可用于治疗特应性皮炎。

3.4 抗氧化 Kirmizibekmez 等［23］发现当甘草西定浓度为0.32 mg/mL 时，可以清除50%的DPPH 自由基，提示甘草西定具有良好的抗氧化活性。Kim 等［49］从抑制皮肤光老化的角度也证实了这一观点。光老化是指慢性紫外线暴露引起的皮肤老化。研究显示甘草西定对ROS 的清除能力高出L-抗坏血酸3.1 倍，抗氧化作用是α-生育酚的1.9 倍，对弹性酶活性的抑制是齐酚酸的2.1 倍，并且有效抑制了MMP-1 蛋白表达，减少了胶原蛋白等的降解，其作用机制可能是甘草西定抑制了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，从而导致c-Jun 和c-Fos 等下游信号分子表达降低。因此，甘草西定可作为抗衰老配方的活性成分。

3.5 神经保护创伤性脑损伤（TBI）是造成残疾或死亡等意外伤害的主要原因，目前尚无有效的治疗方法。Liu等［50］采用改良的重锤法构建了小鼠脑外伤模型，在建模后30 min 给予治疗，结果显示，经甘草西定治疗后TBI 小鼠的脑水肿明显减轻，改良的神经损害严重程度评分（NSS）降低，提示甘草西定有助于促进脑损伤小鼠神经功能的恢复。该研究还发现甘草西定弱化了机体的脂质过氧化作用，增强了内源性抗氧化能力，有效抑制了神经细胞的凋亡，并证实甘草西定可能通过调控FoxO3/Wnt/catenin 通路发挥神经保护作用，这为今后脑外伤的治疗增加了新的候选药物。

3.6 治疗肥胖及其合并症随着饮食结构的改善，肥胖人群的比例在逐年增加，随之而引发的心脑血管疾病、代谢紊乱、肿瘤等各类疾病已造成严重的负担。PTP1B 在体内可通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化，负向调节胰岛素信号的转导，是目前降糖药物的重要靶点之一。叶敏等［51］发现25 μmol/L 甘草西定对PTP1B 的抑制率可达100%，因此甘草西定可用于PTP1B 抑制剂的制备。此外，将负责储能的白色脂肪组织向负责耗能的棕色脂肪样组织转化的过程，称为白色脂肪米色化，是目前肥胖治疗的新方向［52］。刘威等［53］通过构建小鼠的肥胖模型，研究了甘草西定对肥胖及其合并症的治疗作用，发现与对照组相比，甘草西定组小鼠体质量减轻、皮下白色脂肪组织减少、糖耐量和胰岛素敏感性改善，产热基因Ucp1、PGC1α、Cebpβ 表达均升高，并证实甘草西定可直接刺激皮下的白色脂肪米色化。这些研究将为肥胖及其并发症的治疗开辟新的思路。

3.7 抗病毒目前治疗新型冠状病毒（SARS-CoV2）感染的特效药尚未问世，靶向病毒遗传物质形成过程中的关键蛋白是研发抗病毒药物的一种途径［54］。Shah 等［55］以COVID-19 主蛋白酶（3CL pro）、木瓜样蛋白酶（PL pro）、刺突蛋白（S） -血管紧张素转换酶-2 （ACE-2）复合物作为研究靶点，从具有抗冠状病毒作用的植物中筛选出能够抑制靶点蛋白的成分，进行分子对接研究，结果显示甘草西定与刺突蛋白（S） -血管紧张素转换酶-2 （ACE-2）复合物的对接分数为-85.5，氢键相互作用良好。与经典的抗病毒药物阿比多尔相比，甘草西定具有更强的亲和力。ADMET特性研究也提示该化合物是良好的类药性分子，这项研究将有助于推动抗SARS-CoV2 病毒特效药的研发。

3.8 其他临床上常用乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制剂治疗阿尔兹海默病等神经系统退行性疾病。有研究显示，甘草西定对AChE 的抑制率高达82%，因此可将甘草西定用于AChE 抑制剂的制备［51］。