吴学辉，程心玲，潘艳琳，张晓斌，肖 钦*

（1.福建中医药大学附属人民医院药学部，福建 福州 350004； 2.福建省食品药品质量检验研究院，福建 福州 350001）

广藿香为唇形科植物广藿香Pogostemoncablin（Blanco） Benth.的干燥地上部分，用于湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿表证、湿温初起、发热倦怠、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛的治疗［1］，主要含有甾体类、黄酮类、萜类、生物碱类、苯丙素类等成分［2-3］，临床使用广泛。广藿香为福建中医药大学附属人民医院院内制剂藿砂颗粒的君药之一，现收载于2020 年版《中国药典》 一部，该标准使用GC 法对百秋李醇进行含量测定，检索广藿香定量控制相关文献大多为HPLC 法测定，未对检测结果进行有效评价。本研究采集广东、海南、广西、福建4 个省、自治区18 个产地的广藿香药材，采用HPLC-QAMS/GC 法［4-6］对广藿香中新西兰牡荆苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列当苷、异毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黄酮醇、雷杜辛黄酮醇、广藿香酮、百秋李醇含量进行测定，结合主成分分析（PCA）［7-8］、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）［8-9］和加权TOPSIS 法［10-11］，筛选出引起不同批广藿香成分差异的主要标志性成分，同时对不同产地广藿香综合质量进行分析评价，以期为广藿香整体质量控制提供科学的实验依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 新西兰牡荆苷 （批号14022804，纯度99.1%）、异毛蕊花糖苷 （批号15031204，纯度96.1%）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批号PRF7090824，纯度97.3%）、广藿香酮（批号PRF8072523，纯度99.0%） 对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司； 毛蕊花糖苷（批号111530-201914，纯度95.2%）、百秋李醇（批号110772-201909，纯度100.0%） 对照品购自中国食品药品检定研究院； 紫葳新苷Ⅱ （批号CFS202101，纯度98.0%）、藿香黄酮醇 （批号CFS202101，纯度 98.5%）、列当苷 （ 批号CFS202003，纯度98.0%）、雷杜辛黄酮醇（批号CFS202101，纯度98.5%） 对照品购自武汉天植生物技术有限公司； 鼠李素（批号AF21080308，纯度98.0%） 对照品购自成都埃法生物科技有限公司。乙腈、磷酸为色谱纯； 水为纯净水。

广藿香按2020 年版《中国药典》 一部“广藿香” 项下要求叶片筛净，茎洗净润透，切段晒干，按茎叶比80 ∶20 混匀，备用，经福建中医药大学附属人民医院肖钦主任药师鉴定为正品。样品信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.2 仪器 LC-10AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）； Agilent 7820A 型气相色谱仪、Agilent TC C18色谱柱、Agilent HP-5 毛细管柱（美国Agilent公司）； Primaide 1210 型高效液相色谱仪（日本日立公司）； Phenomenex Gemini C18色谱柱 （美国Phenomenex 公司）； Waters ODS C18色谱柱（美国Waters 公司）； XS105 型电子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； FQ-1024 型超声波清洗器（杭州法兰特超声波科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 HPLC-QAMS 多组分定量方法的建立

2.1.1 对照品溶液制备 取新西兰牡荆苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列当苷、异毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黄酮醇、雷杜辛黄酮醇、广藿香酮对照品适量，精密称定，用75%甲醇制成每1 mL 分别含对照品0.834、0.052、2.310、0.616、0.754、0.076、0.102、0.310、0.248、0.972 mg 的贮备液。精密吸取贮备液适量，75%甲醇稀释20 倍制得质量浓度分别为41.70、2.60、115.50、30.80、37.70、3.80、5.10、15.50、12.40、48.60 μg/mL 的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取广藿香粉末（过3 号筛） 约1.0 g，精密称定，置25 mL 具塞锥形瓶中，精密加入75% 甲醇25 mL，称定质量，超声处理45 min，冷却，再次称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.1.3 色谱条件 参考文献 ［12-14］ 报道，Phenomenex Gemini C18色谱柱； 流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～7 min，12.0%A；7 ～20 min，12.0% ～29.0% A； 20 ～38 min，29.0% ～65.0%A； 38～45 min，65.0% ～12.0%A）；体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长309 nm； 进样量10 μL。色谱图见图1，供试品溶液中各成分与相邻色谱峰分离分离度均大于1.5。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1” 项下对照品贮备液适量，用75% 甲醇稀释4、10、20、40、100、200 倍，得6 份不同质量浓度的对照品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标 （X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度试验 精密吸取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定6 次，测得新西兰牡荆苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列当苷、异毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黄酮醇、雷杜辛黄酮醇、广藿香酮峰面积RSD 分别为1.06%、1.53%、0.59%、1.18%、1.03%、1.41%、1.28%、1.14%、1.23%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液适量，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h 在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，测得新西兰牡荆苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列当苷、异毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黄酮醇、雷杜辛黄酮醇、广藿香酮峰面积RSD 分别为1.33%、1.88%、0.94%、1.35%、1.46%、1.78%、1.61%、1.43%、1.59%、1.17%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取广藿香粉末6 份（S1），按 “2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，测得新西兰牡荆苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、列当苷、异毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黄酮醇、雷杜辛黄酮醇、广藿香酮含量RSD分别为1.09%、1.48%、0.57%、1.22%、1.06%、1.43%、1.25%、1.17%、1.22%、0.78%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的广藿香粉末9 份（S1），每份0.5 g，随机平均分为3 组，按80%、100%、120%的水平加入对照品溶液（新西兰牡荆苷0.211 mg/mL、紫葳新苷Ⅱ0.015 mg/mL、毛蕊花糖苷0.807 mg/mL、列当苷0.176、异毛蕊花糖苷0.215 mg/mL、鼠李素0.019 mg/mL、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.031 mg/mL、藿香黄酮醇0.087 mg/mL、雷杜辛黄酮醇0.069 mg/mL、广藿香酮0.335 mg/mL），按 “2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，各成分平均加样回收率分别为98.70%、97.83%、100.20%、98.81%、100.12%、98.23%、98.05%、96.85%、98.39%、98.44%，RSD 分别为1.64%、0.99%、0.87%、0.67%、1.24%、1.33%、1.50%、0.75%、1.49%、1.10%。

2.1.9 相对校正因子 （f） 计算 精密吸取“2.1.4” 项下对照品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，以毛蕊花糖苷为内标，计算其他9种成分相对校正因子，公式为fk/s＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积。计算得毛蕊花糖苷与新西兰牡荆苷、紫葳新苷Ⅱ、列当苷、异毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、藿香黄酮醇、雷杜辛黄酮醇和广藿香酮的平均相对校正因子分别为0.785 8、4.738 9、0.620 5、0.529 0、2.453 9、1.783 4、0.937 5、1.427 1、0.572 9，RSD 分别为1.86%、1.53%、1.10%、0.78%、1.05%、1.30%、1.93%、1.67%、1.06%。

2.1.10 耐用性考察 精密吸取“2.1.1” 项下对照品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，分别考察色谱仪（LC-10AT、Primaide 1210）、色谱柱 （Phenomenex Gemini C18、Waters ODS C18、Agilent TC C18）、体积流量 （0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱温（25、30、35 ℃） 等条件对f的影响。结果，不同仪器及色谱柱条件下毛蕊花糖苷与其他9 种成分的平均相对校正因子分别为0.784 2、4.736 5、0.624 3、0.524 8、2.455 6、1.785 2、0.936 0、1.427 0、0.572 5，不同体积流量条件下平均相对校正因子分别为0.785 0、4.738 9、0.623 8、0.526 1、2.458 1、1.785 0、0.937 5、1.427 7、0.572 2，不同柱温条件下平均相对校正因子分别为0.790 3、4.739 1、0.622 1、0.525 6、2.461 9、1.786 5、0.934 8、1.429 5、0.568 6，RSD 值均小于2.0%，表明不同仪器及色谱柱、体积流量、柱温对所建立的f无显著性影响，耐用性良好。

2.1.11 色谱峰定位 精密吸取“2.1.1” 项下对照品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，考察色谱仪（LC-10AT、Primaide 1210）、色谱柱（Phenomenex Gemini C18、Waters ODS C18、Agilent TC C18） 对相对保留时间值（t） 的影响，结果见表3。可知各成分相对保留时间RSD 均小于2.0%，相对保留时间值法可用于广藿香中各成分色谱峰定位。

表3 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.2 百秋李醇GC 定量检测方法 取广藿香粉末（过3 号筛） 约3.0 g，精密称定，按2020 年版《中国药典》 一部［1］“广藿香” 项下方法对百秋李醇进行定量检测。

2.3 多组分含量测定 取18 批广藿香 （S1 ～S18），按“2.1.2” 项下方法制备广藿香供试品溶液，平行3 份，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表4。经SPSS 26.0 软件正态性检验和方差齐性检验，广藿香中各成分2 种方法含量数据符合正态分布（P＞0.05） 和方差齐（P＞0.05），t检验结果显示2 种方法结果无显著性差异（P＞0.05），表明HPLC-QAMS 法准确可靠； 百秋李醇GC 法稳定，结果准确。

表4 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.4 Results of content determination for various constituents （n＝3）

2.4 多元统计分析

2.4.1 PCA 以18 批广藿香中10 种成分HPLCQAMS 法测定结果以及百秋李醇GC 法测定结果为变量，采用SPSS 26.0 软件PCA 分析对多维数据进行降维。结果第1、2 个主成分的方差贡献率分别为62.880%、24.098%，累计方差贡献率为86.978%，表明前2 个主成分可以代表广藿香中11种成分86.98%的信息量，故确定采用前2 个主成分作为分析对象。由广藿香主成分矩阵结果可知，第1 主成分信息主要由新西兰牡荆苷、紫葳新苷Ⅱ、毛蕊花糖苷、鼠李素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、雷杜辛黄酮醇、广藿香酮、百秋李醇组成，第2 主成分信息主要由列当苷、异毛蕊花糖苷、藿香黄酮醇组成。进一步应用SIMCA 14.1 软件对18 批广藿香样品构建PCA 模型（图2），提取出2 个主成分R2X为0.870，表明建立的模型稳定性较高，不同产地广藿香样品呈现一定的聚集性，S1～S8 位于得分图中上部，S9 ～S12 位于得分图左下角，S13～S18 位于得分图右侧。

图2 PCA 得分图Fig.2 Score plot for PCA

2.4.2 OPLS-DA 以18 批广藿香中10 种成分HPLC-QAMS 法测定结果以及百秋李醇GC 法测定结果为变量，采用SIMCA 14.1 软件OPLS-DA 分析，挖掘影响广藿香产品质量差异的主要潜在标志物，得OPLS-DA 模型。结果显示模型稳定可靠、预测能力好，累积解释能力参数R2X 为0.950、R2Y 为0.858，预测能力参数Q2为0.744，均大于0.5； 不同产地18 批广藿香样品分类聚集结果与PCA 结果相吻合。对构建的OPLS-DA 模型中2 个主成分进行200 次置换检验（图3）。结果模型可靠，且未过度拟合，预测能力好。采用OPLS-DA模型中变量重要性投影（VIP） 值筛选影响广藿香化学成分差异的标志性成分（图4），VIP 值越大，表明该成分对区分不同产地广藿香整体质量的贡献度越大。结果VIP ＞1.0 的指标成分分别为成分3（毛蕊花糖苷，2.014 0）、成分11 （百秋李醇，1.548 0）、成分10 （广藿香酮，1.277 0） 和成分4 （列当苷，1.009 0），表明上述成分对不同产地广藿香样品的分类聚集影响显著，可能是影响广藿香产品质量差异的主要潜在标志物。

图3 OPLS-DA 分析置换检测结果图Fig.3 Permutation test results graph for OPLS-DA

图4 OPLS-DA 分析VIP 值图Fig.4 VIP value graph for OPLS-DA

2.5 加权TOPSIS 分析

2.5.1 原始数据归一化 以18 批广藿香中11 种成分含量结果为变量，建立数据矩阵Xnm（n＝1，2，3，……，18；m＝1，2，3，……，11），采用越大越优型指标计算公式对原始数据进行归一化，式中max （Xm） 和min（Xm） 分别指第m个指标18 批样品含量的最大值和最小值，得归一化后数据矩阵Ynm。

2.5.2 加权决策矩阵 以OPLS-DA 分析中影响广藿香化学成分差异的VIP 值为11 个指标权重（Wm），按加权决策计算公式Znm＝Ynm×Wm对归一化后数据矩阵进行加权处理，得加权决策矩阵Znm，最优方案矩阵，最劣方案矩阵均为0。

2.5.3 相对贴近度计算及样品优劣评价 按欧氏距离计算公式和分别计算18 批广藿香样品与最优方案的欧氏距离以及与最劣方案的欧氏距离，再根据相对贴近度计算公式计算18 批广藿香样品的相对贴近度Dn，Dn值越大，被评价的广藿香样品质量最优，反之则最差。按照Dn值大小对18 批广藿香样品质量优劣进行排序，结果见表5。结果显示排名前6 位依次为广东石牌、棠下、高要、阳春、遂溪、徐闻，广西和海南居中，福建位于排名后四位。

表5 加权TOPSIS 模型综合评价结果Tab.5 Results of comprehensive evaluation using weighted TOPSIS model

3 讨论

本研究对提取溶剂 （50% 甲醇［13］、75% 甲醇［14］、100% 甲醇［15-16］、乙醇［17-19］）、提取方式（超声和加热回流） 和提取时间 （30、45、60 min） 进行了对比考察，最终确定采用75%甲醇超声提取45 min 对广藿香供试品溶液进行制备。在筛选流动相时，首先对甲醇-水、乙腈-水进行了考察，结果乙腈-水相对稳定，但个别色谱峰出现拖尾变形，同时检验用时较长，考虑加入0.1%磷酸［14-15］、0.1% 冰醋酸和0.1% 甲酸［13］加以改善，最终确定采用乙腈-0.1% 磷酸为流动相梯度洗脱。

本研究采用HPLC-QAMS 法对广藿香中新西兰牡荆苷等10 种成分含量进行了同步检测，方法操作便捷，结果准确，较普通多组分检测方法，大大降低了检验成本，有效避免了部分对照品不稳定等因素影响，有效推动了方法的普及应用。百秋李醇挥发性较强，HPLC 法难以确保检测的准确度，参考广藿香现行标准采用GC 法对百秋李醇进行含量检测。广藿香中11 种成分含量检测结果显示，不同产地广藿香质量差异较大。多元统计分析结果显示毛蕊花糖苷、百秋李醇、广藿香酮和列当苷可能是影响广藿香产品质量的主要潜在标志物。加权TOPSIS 法结果显示广东产广藿香质量最优，位于排名前6 位，其次为广西和海南产广藿香，福建产广藿香位于排名后4 位，所建立的方法能够有效地区分不同产地广藿香产品质量优劣。

综上所述，本研究建立的HPLC-QAMS/GC 多组分定量联合多元统计分析及加权TOPSIS 方法，操作便捷，结果准确，客观全面，为广藿香资源的合理开发和利用、优质种源的筛选和栽培以及道地性研究提供参考和借鉴。