武鑫玥，丁 银，赵程成，苟晓玲，赵紫薇，张 静，唐 策*，范 刚*

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 2.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137）

水柏枝为常用藏药，具有清热解毒、发散透疹的功效，是藏医治疗热毒症、黄水病的常用药材之一，具有较高的药用价值和良好的开发与应用前景。目前水柏枝属植物化学成分的研究比较少，主要含有黄酮类与酚酸类化合物，这些化学成分具有抗炎、镇痛、抑菌、抗氧化等活性［1］。已有研究采用HPLC 法测定了水柏枝中槲皮素、槲皮苷、没食子酸的含量［2-3］，但其他化学成分还未见分析报道。

水柏枝为典型的多基原药材，课题组前期调查发现，秀丽水柏枝（MyricariaeelegansRoyle）、具鳞水柏枝（M.squamosaDesv.）、三春水柏枝（M.paniculateP.Y.Zhang ＆ Y.J.Zhang）、小花水柏枝（M.wardiiMarquand） 为目前使用的主流品种。由于遗传背景不同，水柏枝不同品种的化学成分可能存在一定的差异，进而影响其质量的稳定性和临床疗效。因此，有必要采用现代科学技术筛选种间差异性成分，以促进其质量控制和临床合理利用。

UPLC-Q-TOF/MS 法具有分析速度快、灵敏度高、定性能力强等优点，为中药、藏药内在质量的综合评价提供了新的分析方法，目前已成功应用于当归等药材的品种差异研究中［4］。因此，本研究主要采用基于UPLC-Q-TOF-MS 的分析技术分别对不同基原水柏枝药材进行化学成分分析，并结合偏最小二乘法判别分析和方差分析，寻找种间差异成分，以期为其品种鉴定、质量控制及临床应用等提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters Acquity UPLCTM超高效液相色谱仪（配有四元溶剂管理系统、样品管理系统、PDA 检测器、Empower 色谱工作站）、Q-TOF analyzer in a SYNAPT G2 HDMS system 高分辨质谱仪（配有ESI 接口、MarkerLynx 4.1 工作站）（美国Waters 公司）； Sorvall Legend Micro 17 高速离心机、微量移液枪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；BT125D 十万分之一电子天平 （德国Sartorius 公司）； KQ-500E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂 甲醇、乙腈 （色谱纯，美国J.T.Baker 公司）； 甲酸、亮氨酸脑啡肽（色谱纯，美国Sigma 公司）； 水为蒸馏水［屈臣氏集团（香港） 有限公司］； 其余试剂均为分析纯。

1.3 药材 本研究共收集27 批不同品种的水柏枝样品，经重庆市中药研究院秦松云研究员鉴定为秀丽水柏枝M.elegans、具鳞水柏枝M.squamosa、三春水柏枝M.paniculata和小花水柏枝M.wardii。样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 UPLC-Q-TOF/MS 条件

2.1.1 色谱 Acquity UPLC®BEH C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）； 流动相0.1%甲酸水（A） -0.1% 甲酸乙腈 （B），梯度洗脱 （0 ～1 min，4% B； 1 ～4 min，4% ～5% B； 4 ～6 min，5% ～7%B； 6 ～10 min，7% B； 10 ～13 min，7% ～14%B； 13 ～18 min，14% B； 18 ～21 min，14% ～18%B； 21 ～25 min，18% ～37% B； 25 ～26 min，37% ～60% B； 26 ～29 min，60% B； 29 ～32 min，60% ～80% B； 32 ～35 min，80% ～95% B； 35 ～40 min，95%B； 40 ～41 min，95% ～99% B； 41 ～46 min，99% B； 46 ～48 min，99% ～4% B； 48 ～50 min，4%B）； 体积流量0.4 mL/min； 柱温40 ℃；进样量1 μL。

2.1.2 质谱 Waters SYNAPT G2 HDMS 系统； 雾化、锥孔气氮气； 源温度150 ℃； 反向锥孔气体体积流量50 L/h； 脱溶剂气温度450 ℃； 脱溶剂气体体积流量800 L/h； 锥空电压40 V； 萃取锥空电压4 V； 毛细管电压3.0 kV （正）、2.5 kV （负）； 扫描时间0.3 s； 扫描间隔0.02 s； 扫描范围m/z100～1 500； 锁定质量数 （亮氨酸脑啡肽）m/z556.277 1 ［M+H］+，54.261 5 ［M-H］-。

2.2 供试品溶液制备 称取水柏枝粉末（过3 号筛） 约1 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇30 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz） 30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取滤液，13 000 r/min 离心15 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 质谱分析 在正、负离子模式下，同时进行一级和二级扫描。通过精确分子量、出峰时间、裂解碎片、加合离子峰（ ［M+H］+、［M-H］-、［2M+H］+等），确认和指证化合物。按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项条件下进样测定，对27 批水柏枝进行分析，得到水柏枝药材的正、负离子状态下扫描总离子流图。在正离子模式下，除出现［M+H］+的准分子离子峰外，大部分化合物均显示出强丰度的［M+Na］+的加合离子峰，有时还会出现［2M+H］+、［2M+Na］+离子峰；在负离子模式下，准分子离子峰一般为［M-H］-，同时还会出现［M+Na-2H］-、［2M-H］-等离子峰。通过对准分子离子峰上对应的分子量进行拟合计算，按保留时间先后顺序列出。从中得到36 个化合物，包括6 个黄酮类（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、木犀草素、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等）、17 个酚酸类（没食子酸、鞣花酸等）、2 个生物碱类（N-阿魏酰酪胺、N-阿魏酰基-4-O-甲基酪胺）、3 个氨基酸类（脯氨酸、苯丙氨酸等）、8 个其他类（水柏枝素A、腺苷等）。水柏枝基峰色谱图见图1，鉴定的化合物质谱裂解信息见表2。

图1 水柏枝总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of Myricariae Ramulus

表2 水柏枝主要化学成分的质谱信息Tab.2 MS information of the major constituents in Myricariae Ramulus

2.4 化学计量学分析

2.4.1 偏最小二乘法分析 采用SIMCA-P 软件的偏最小二乘法（PLS-DA） 对各化合物的质谱峰面积数据进行建模，分别在正、负离子模式下对4 种基原水柏枝进行比较，见图2。PLS-DA 三维模型中，可直观看出不同基原的水柏枝明显分为4 类。

图2 水柏枝的PLS-DA 三维得分图Fig.2 PLS-DA three-dimensional score plot of Myricariae Ramulus

2.4.2 差异代谢物筛选 观察不同样品的分类情况，并从大量多维数据中找出贡献于分类的主要差异代谢物，但无法确定观察到的差异是否具有统计学意义（显著性），因此需要采用其他方法进一步验证PLS-DA 结果。本研究采用方差分析评价这些成分在4 种基原间的差异是否具有显著性。结合VIP＞1 和P＜0.05 这2 个标准筛选潜在的差异成分，最终筛选出7 种具有统计学意义的种间差异成分，分别为水柏枝素A、阿福豆苷、对羟基桂皮酸、3，4-二甲氧基没食子酸、没食子酸甲酯、2，4，6-三羟基苯甲酸甲酯、香草酸甲酯，详见图3、表3。

图3 种间差异成分峰面积的方差分析Fig.3 Analysis of variance for peak area of interspecific differential components

表3 4 种基原水柏枝潜在差异成分的方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis for the potential component differences of 4 species of Myricariae Ramulus

3 小结与讨论

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS 定性技术，首次对水柏枝药材的化学成分进行了全面分析，结合文献报道及化合物的质谱裂解规律，最终鉴定了36个化合物，包括6 个黄酮类，17 个酚酸类，2 个生物碱类，3 个氨基酸类，以及8 个其他类。其中，二-O-没食子酰-D-葡萄糖、二-O-没食子酰-鞣花酰-D-葡萄糖、三-O-没食子酰-D-葡萄糖、四-O-没食子酰葡萄糖、五-O-没食子酰-D-葡萄糖为首次从水柏枝药材中鉴定的化学成分。

此外，结合多元统计和方差分析方法，利用P＜0.05 标准筛选4 组样品间的差异成分，最终确定7 种潜在的种间差异性成分，包括水柏枝素A、阿福豆苷、对羟基桂皮酸、3，4-二甲氧基没食子酸、没食子酸甲酯、2，4，6-三羟基苯甲酸甲酯和香草酸甲酯。这些化合物为区别不同基原水柏枝药材的化学标志物，今后可应用于水柏枝药材的品种鉴定。此外，由于这7 种化学成分的差异，可能会影响不同基原水柏枝药材的质量，今后应结合与功效相关的药理活性进一步评价不同品种的质量差异，为水柏枝药材的质量控制和临床合理应用提供参考依据。