程宁波，刘文君，罗京超，王正宽

（江苏康缘药业股份有限公司，中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001）

水飞蓟Silybummarianum（L.） Gaertn 是菊科水飞蓟属草本植物，原产于南欧、北非。水飞蓟素是从水飞蓟种子中提取的一类新型黄酮类化合物，具有保肝、降血脂、抗氧化、防止糖尿病、保护心肌、抗血小板聚集、抗肿瘤等作用［1-2］。水飞蓟素主要包括水飞蓟宾A、水飞蓟宾B、异水飞蓟宾A、异水飞蓟宾B、水飞蓟宁、水飞蓟亭［3-5］，这6种成分为欧洲药典7.0 及美国药典（USP32-NF27）水飞蓟提取物质量标准中水飞蓟素含量测定的检测指标。水飞蓟素可用乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂从水飞蓟籽粕或水飞蓟壳中提取，其中用乙醇从水飞蓟壳中提取水飞蓟素的提取率较高，且较其他溶剂绿色环保［6-9］。有文献研究了不同提取条件对水飞蓟宾的影响，结果表明，水飞蓟宾对温度比较敏感，温度越高，变化越快，在碱溶液中不稳定，在酸溶液中比较稳定［10-11］。课题组在用95%、90%、85%乙醇提取水飞蓟素时发现，提取液在自然光条件放置时，其中水飞蓟宁含量均逐渐降低。基于此，课题组对水飞蓟壳90%乙醇提取液进行光稳定性考察，以期为其进一步研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪（配有四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、VWD 检测器）、Aglient 1290 型液相色谱-质谱联用仪（配备DAD 检测器、Q-TOF 6538 质谱仪）、Agilent C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm） （美国Agilent 公司）； Thermo U3000 型半制备液相色谱仪（配有二元梯度泵，柱温箱、VWD 检测器，美国Thermo 公司）； AL204 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；LHH-150GSP 综合药品稳定性试验箱（上海赛欧试验设备有限公司）。

1.2 试剂 甲醇、无水乙醇、磷酸均为分析纯，购自南京化学试剂股份有限公司； 水为超纯水。

1.3 药物 水飞蓟壳（批号201129） 购自盘锦格润生物有限公司，经江苏康缘药业股份有限公司王正宽工程师鉴定为正品。水飞蓟宁对照品（批号141019） 购自成都普菲德对照品科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流动相80% 甲醇 （含0.5% 磷酸）（A） -20%甲醇（含0.5%磷酸） （B），梯度洗脱（0～5 min，15%A； 5 ～20 min，15% ～18%A； 20 ～35 min，18% ～35%A； 35 ～60 min，35%A）； 体积流量1 mL/min； 柱温40 ℃； 检测波长288 nm； 进样量2 μL。

2.2 供试品溶液制备 取水飞蓟壳100 g，依次用4 倍量90%乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，过滤，将滤液分装至10 mL 西林瓶中。取3组供试品溶液压塞，轧盖，分别置于室温自然光照、室温避光、强光照射保存； 另取3 组供试品溶液，第一组充入氮气，第二组充入空气，第三组充入氧气，压塞，轧盖，分别强光照射放置。

2.3 对照品溶液制备 精密称取水飞蓟宁对照品约5 mg，置于10 mL 量瓶中，90%乙醇溶解并定容至刻度，混匀，0 ～4 ℃冰箱放置，备用。精密称取对照品溶液适量用90% 乙醇稀释，装入10 mL西林瓶中，压塞，轧盖，强光照射放置。

2.4 光照前后的样品比较 取供试品、对照品溶液适量，并分别强光照射2.5、5 d （稳定性试验箱； 温度25 ℃； 光源日光灯； 光照强度4 500 Lx），在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，与未强光照射的供试品、对照品相比，两者中的水飞蓟宁含量在强光照射下发生降解，降解产物含量随光照时间的增加而升高。

图1 不同光照时间的样品色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of samples with different illumination time against lights

2.5 不同光照强度的样品比较 分别取供试品溶液，以及其避光放置、自然光照、强光照射5 d 所得样品，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图2。由此可知，与供试品溶液相比，溶液中的水飞蓟宁在避光条件下放置5 d 稳定性良好，色谱峰无明显变化； 在自然光照和强光照射下发生降解，降解产物含量随光照强度的增加而升高。

图2 不同光照强度照射的样品色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of samples with different light intensity against lights

2.6 充入不同气体的光照样品比较 分别取供试品溶液，以及其充氮气组、充空气组、充氧气组溶液分别强光照射5 d，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图3。由此可知，与供试品溶液相比，在强光照射5 d 后溶液中的水飞蓟宁发生降解，降解产物含量随溶液中含氧量的增加而升高。

图3 充入不同气体的光照样品色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of samples with adding different gas against lights

2.7 光照前后样品的质谱分析

2.7.1 质谱条件 ESI 离子源，正负离子模式；干燥气温度350 ℃； 干燥气流量10 L/min； 雾化气压力50.0 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 毛细管电压（+） 4 000 V，（-） 3 500 V； 毛细管出口电压135 V； 锥孔电压65 V； 扫描范围m/z100～1 500。

2.7.2 结果 分别取供试品溶液避光放置5 d、强光照射5 d 的样品，在“2.7.1” 项质谱条件下进样测定，结果见图4、表1。由此可知，供试品溶液强光照射样品与避光样品相比，色谱峰1、3 ～7的峰高及峰面积无明显差异； 强光照射样品的色谱峰2 降低，色谱峰8 升高，在光照条件下，色谱峰2 的化合物发生降解，降解产物为色谱峰8。

表1 化合物1～8 的二级质谱的主要碎片峰Tab.1 Compounds 1-8 secondary mass spectometry fragments of the main peak

图4 不同光照强度照射样品的质谱图Fig.4 Mass spectrograms of samples with different light intensity against lights

2.8 化合物8 的分离 取供试品溶液强光照射5 d的样品减压浓缩回收溶剂，干膏用甲醇溶解，经半制备HPLC 纯化，以甲醇-0.1% 甲酸水 （24% ～25.7%甲醇） 梯度洗脱（柱温30 ℃，检测波长288 nm），得到化合物8 （5.3 mg，tR＝15.5 min）。

2.9 化合物8 的结构鉴定 白色无定型粉末，HR-ESI-MSm/z： 499.123 5 ［M+H］+，分子式C25H22O11，不饱和度 15。1H-NMR （400 MHz，CD3OD）δ： 6.88 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-2″），6.78 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-5″），6.74 （1H，dd，J＝8.1，1.7 Hz，H-6″），6.28 （1H，s，H-6＇），5.96 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），5.94（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.11 （1H，d，J＝11.4 Hz，H-2），4.58 （1H，d，J＝11.4 Hz，H-3），4.22 （1H，dd，J＝9.3，5.2 Hz，H-γ），3.99 （1H，d，J＝2.6 Hz，H-2＇），3.97 （1H，d，J＝4.9 Hz，H-γ），3.86 （3H，s，3″-OCH3），3.52 （1H，d，J＝10.8 Hz，H-5＇），3.00 （1H，ddd，J＝12.3，6.8，5.3 Hz，H-β），2.84 （1H，dd，J＝12.5，10.9 Hz，H-α）；13C-NMR （100 MHz，CD3OD）δ： 198.0 （C-4），177.9 （C-3＇），176.3 （ C-4＇），168.7 （ C-7），165.2 （ C-5），164.3 （ C-9），149.2 （ C-3″），146.9 （ C-4″），133.1 （ C-1＇），133.0 （ C-1″），128.2 （ C-6＇），122.2 （ C-6″），116.4 （ C-5″），113.1 （ C-2″），101.5 （C-10），97.5 （C-6），96.4 （C-8），82.1（C-2），74.9 （C-3），70.3 （C-γ），56.4 （3″-OCH3），51.1 （C-5＇），43.5 （C-2＇），43.5 （Cα），41.3 （C-β）。以上数据与文献［12］ 报道基本一致，故鉴定为silyamandin。

3 结果与讨论

水飞蓟90%乙醇提取液的光稳定性考察结果表明，水飞蓟宁在光照条件下不稳定。水飞蓟宁（色谱峰1） 含量与光照强度及氧气含量成反比，而光降解产物（色谱峰2） 含量与光照强度及氧气含量成正比。质谱分析结果表明，化合物1 ～7 的一级质谱有着相同的准分子离子峰m/z481 ［MH］-，这7 种成分的相对分子质量均为482，且二级质谱的主要碎片离子峰与文献［5，13-14］ 报道的基本一致，化合物1 ～7 分别为水飞蓟亭A、水飞蓟宁、水飞蓟亭B、水飞蓟宾A、水飞蓟宾B、异水飞蓟宾A、异水飞蓟宾B。化合物8 在正离子模式下的质谱峰m/z499.123 8 ［M + H］+，516.150 0 ［M + NH4］+，521.105 9 ［M + Na］+，1 019.223 5 ［2M+H］+； 负离子模式下的质谱峰m/z497.107 2 ［M-H］-、995.223 8 ［2M-H］-； 化合物8 的分子量为498。文献［15］ 发现了水飞蓟宾或异水飞蓟宾同分异构体的氧化产物的质谱峰m/z499 ［M+H］+，521 ［M+Na］+，分子量为498；本研究从供试品溶液光照氧化后的样品中，分离得到化合物8，并通过核磁波谱进行结构鉴定，经比较与文献［12］ 报道的从水飞蓟酊剂中分离得到一个新化合物silyamandin 的氢谱、碳谱数据基本一致，因此确定化合物8 为silyamandin。

本研究结果表明，供试品溶液中的水飞蓟宁在光照下与一分子O2发生氧化反应并脱去一分子H2O 生成silyamandin［12］，而水飞蓟亭A、水飞蓟亭B、水飞蓟宾A、水飞蓟宾B、异水飞蓟宾A、异水飞蓟宾B 对光照均稳定。水飞蓟提取物中主要的黄酮木脂素化合物见图5。

图5 水飞蓟提取物中主要的黄酮木脂素化合物Fig.5 Flavonolignans of Silybum marianum extract

水飞蓟宁为水飞蓟提取物质量标准中水飞蓟素含量测定指标之一，具有较为显著的抗光老化作用［16］。本研究的研究结果提示水飞蓟提取物生产过程中应避免光照，防止水飞蓟宁发生降解； 同时为水飞蓟宁光氧化产物silyamandin 的制备提供参考。课题组后续将对水飞蓟宁光氧化产物的药理活性进行研究，为其开发利用提供依据。