叶 丹，马晓宇，钊浩然，乔会林，张选明*

（1.石河子大学第一附属医院，新疆 石河子 832000； 2.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000）

动脉粥样硬化是常见的慢性炎症性疾病，也是心血管疾病的重要病理基础，其病理过程以脂质代谢紊乱和炎症为主。有研究发现，脂质代谢紊乱和炎症反应是动脉粥样硬化发生的关键因素之一［1-2］。肝脏常作为脂代谢基础研究的首选组织，是参与脂代谢的重要枢纽器官，也是脂类合成和分解的重要场所。长期的高脂饮食不仅会导致肝脏调节脂代谢作用紊乱，还会导致炎症反应的发生，是诱导机体动脉粥样硬化发生的关键因素［3］。肝脏脂质代谢水平已成为机体脂代谢的重要指标［4］。胆固醇逆向转运 （reverse cholesterol Transport，RCT） 是脂质代谢的重要途径，RCT 异常是动脉粥样硬化斑块形成的重要环节［5-6］。PPARγ/LXRα/ABCA1 信号通路是调节脂质代谢的经典通路，可减缓动脉粥样硬化的发生发展［7］。

新塔花ZiziphorabungeanaJuz.是唇形科新塔花属的半灌木植物，因其味芳香，又称芳香新塔花，其地上部分作为新疆传统药材，常用来治疗心血管疾病。芳香新塔花总黄酮是芳香新塔花发挥药理作用的重要物质基础［8］。课题组前期研究发现，芳香新塔花总黄酮可抑制细胞凋亡和巨噬细胞炎症，激活细胞自噬，缓解血管内皮细胞损伤，减轻动脉粥样硬化［9-10］。本研究旨在探究芳香新塔花总黄酮调控PPARγ/LXRα/ABCA1 通路减轻小鼠肝脏脂质沉积，抑制动脉粥样硬化的作用，以期为芳香新塔花总黄酮的临床应用提供理论依据和数据支持。

1 材料

1.1 动物 60 只健康雄性载脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-） 小鼠，8 周龄，体质量18 ～22 g； 12 只健康雄性C57BL/6J 小鼠，8 周龄，体质量18 ～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2016-0006］，饲养于新疆医科大学SPF 级动物实验室［实验动物使用许可证号SYXK （新） 2018-0003］，环境温度18～25 ℃，相对湿度50% ～60%，12 h/12 h 光/暗循环，自由摄食、饮水。ApoE-/-和C57BL/6J 小鼠适应性喂养7 d 后开始实验。

1.2 药物 芳香新塔花总黄酮，由新疆名医名方与特色方剂学实验室制备，总黄酮含量为63%。阿托伐他汀片，规格20 mg/片，批号FG0733，购自辉瑞制药有限公司。

1.3 试剂 氨基甲酸乙酯（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号C10287811）； 改良油红O 染色试剂盒、RIPA 裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号20211112、20210928）； 白介素-1β （IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1 （MCP-1） ELISA 试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司，批号A201B11115、A28711221）； 白介素-18 （IL-18）ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号JC5DHW45W4）； 血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（NEFA）、游离胆固醇（FC） 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20220512、20220513、20220510、20220317）；BCA 蛋白定量试剂盒（合肥白鲨生物科技有限公司，批号21336657）； 三磷酸腺苷结合盒转运体A1 （ATP-binding cassette transporter，ABCA1） 抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号80x8775）； 过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）、肝X 受体α （liver X receptor α，LXRα）、ABCG1抗体 （武汉三鹰生物技术有限公司，批号10015912、10016201、00057963）； β-actin、山羊抗兔二抗、超敏ECL 化学发光试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号 AC220110015、CR2110082、CR2112141）； 山羊抗鼠二抗 （北京中杉金桥生物技术有限公司，批号224800105）。

1.4 仪器 AU5811 型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）； 1510 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； Nikon Eclipse ci 型光学显微镜（日本尼康公司）； DYCZ-40D 型电泳槽、DYCZ-24DZ 型电转仪（北京六一生物科技有限公司）； JP-K600Plus 型化学发光仪（上海嘉鹏科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 ApoE-/-小鼠给予高脂饲料（配方为0.75%胆固醇、15%猪油、84.25% 普通饲料） 喂养8 周后，随机分为模型组、阿托伐他汀组（3 mg/kg） 及芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组（25、50、100 mg/kg），每组12 只，灌胃给予相应剂量药物干预12 周，给药同时继续饲喂高脂饲料； 另取12 只C57BL/6J 小鼠为空白组，灌胃给予生理盐水12 周，同时喂养普通饲料，每周称定1 次小鼠体质量以调整给药剂量。

2.2 取材 给药12 周后，小鼠禁食不禁水过夜，以20%乌拉坦腹腔注射进行麻醉，摘眼球取血，血液4 ℃静置30 min 后3 000 r/min 离心15 min，吸取上层血清，于-80 ℃冰箱中保存。取血后处死小鼠，分离肝脏和主动脉，生理盐水洗去血液，将一部分固定在预冷的4%多聚甲醛固定液中，用于后续切片制备与染色； 其余部分包裹于锡纸后投入液氮中速冻，用于后续分子学相关实验。

2.3 指标检测

2.3.1 油红O 染色观察肝组织脂质沉积情况 将肝组织于4%多聚甲醛固定液中固定24 h 后开始脱水、包埋、切片，将切片置于油红O 染液中染色8 min，蒸馏水清洗3 次，每次5 min，置于75%乙醇中分化3～5 s，自来水清洗终止分化，苏木素染液染色90 s，自来水清洗3 次，每次5 min，甘油明胶封片，于光学显微镜下观察并拍照，分析油红O 染色面积占比。

2.3.2 HE 染色观察主动脉斑块形态 将主动脉组织经脱水、透明、包埋后制备5 μm 切片，间隔5 片保留1 片，将切片经60 ℃烘烤30 min 后脱蜡复水，蒸馏水清洗3 次，苏木素染液染色10 min，自来水清洗3 次，伊红染液染色30 s，中性树胶封片，于显微镜下观察并拍照。

2.3.3 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平检测采用全自动生化分析仪检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。

2.3.4 ELISA 法检测血清炎症因子IL-18、IL-1β、MCP-1 水平 根据ELISA 试剂盒说明书检测血清IL-18、IL-1β、MCP-1 水平。

2.3.5 肝组织TC、TG、NEFA、FC 水平检测 取适量肝组织，加入提取液进行匀浆，4 ℃、3 000 r/min 离心5 min，取上清液，根据试剂盒说明书检测肝组织TC、TG、NEFA、FC 水平。

2.3.6 Western blot 法检测肝组织PPARγ/LXRα/ABCA1 通路相关蛋白表达 取适量肝组织，加入RIPA 组织裂解液后置于冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液即为总蛋白，BCA 法进行蛋白定量，蛋白样本变性后经SDSPAGE 凝胶电泳、转膜、封闭，加一抗PPARγ（1 ∶4 000）、LXRα （1 ∶6 000）、ABCA1 （1 ∶2 000）、ABCG1 （1 ∶800） 4 ℃孵育过夜，加二抗（1 ∶20 000） 室温孵育1 h，化学法发光、显影，采用Image J 软件分析条带灰度值，以β-actin 为内参计算目的蛋白相对表达量。

2.4 统计学分析 通过SPSS Statistics 26.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，组间两两比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 芳香新塔花总黄酮对动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质沉积的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝组织脂滴面积增加（P＜0.01）； 与模型组比较，阿托伐他汀组和芳香新塔花总黄酮中、高剂量组小鼠肝组织脂滴面积减少（P＜0.05，P＜0.01），见图1。

图1 各组小鼠肝组织油红O 染色（×200，±s，n＝3）Fig.1 Results of oil red O staining upon mouse liver tissue of each group （×200，±s，n＝3）

3.2 芳香新塔花总黄酮对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块形态的影响 空白组可见动脉管壁层次清晰，内膜平滑完整规则，无粥样斑块沉积； 与空白组比较，模型组可见动脉管壁内膜明显增厚，斑块体积大、数量多，易损斑块特征明显，夹杂泡沫细胞； 与模型组比较，阿托伐他汀组和芳香新塔花总黄酮各剂量组内皮细胞排列较整齐，动脉管壁内膜厚度缩窄，主动脉根部斑块面积减小，见图2。

图2 各组小鼠主动脉HE 染色（×200）Fig.2 Results of HE staining upon mouse aorta of each group （×200）

3.3 芳香新塔花总黄酮对动脉粥样硬化小鼠血脂水平的影响 与空白组比较，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平升高（P＜0.05），HDL-C 水平降低（P＜0.05）； 与模型组比较，阿托伐他汀组和芳香新塔花总黄酮中、高剂量组小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平降低 （P＜0.01），HDL-C 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平比较（mmol/mL，±s，n＝6）Tab.1 Comparison of mouse serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in each group （mmol/mL，±s，n＝6）

表1 各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平比较（mmol/mL，±s，n＝6）Tab.1 Comparison of mouse serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in each group （mmol/mL，±s，n＝6）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别TCTGLDL-CHDL-C空白组5.30±5.700.79±0.301.01±1.214.46±0.69模型组20.44±1.70*1.55±0.36*5.32±0.92*1.40±0.61*阿托伐他汀12.26±1.14△△0.84±0.22△△2.53±0.86△△3.62±0.43△△芳香新塔花总黄酮低剂量组15.82±2.891.17±0.253.71±0.452.31±1.11芳香新塔花总黄酮中剂量组13.55±2.18△0.97±0.13△3.25±0.90△2.92±0.45△芳香新塔花总黄酮高剂量组12.77±1.69△△0.87±0.34△△2.78±0.82△△3.26±0.80△△

3.4 芳香新塔花总黄酮对动脉粥样硬化小鼠血清炎症因子水平的影响 与空白组比较，模型组小鼠血清炎症因子IL-18、IL-1β、MCP-1 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阿托伐他汀组和芳香新塔花总黄酮中、高剂量组小鼠血清IL-18、IL-1β、MCP-1 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），芳香新塔花总黄酮低剂量组小鼠血清IL-18、MCP-1 水平降低（P＜0.01），见表2。

表2 各组小鼠血清IL-18、IL-1β、MCP-1 水平比较（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of mouse serum levels of IL-18，IL-1β and MCP-1 in each group （±s，n＝5）

表2 各组小鼠血清IL-18、IL-1β、MCP-1 水平比较（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of mouse serum levels of IL-18，IL-1β and MCP-1 in each group （±s，n＝5）

注： 与空白组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别IL-18/（ng·mL-1）IL-1β/（pg·mL-1）MCP-1/（pg·mL-1）空白组36.14±3.5910.45±1.67360.99±23.91模型组84.10±4.26**25.99±2.13**925.37±78.50**阿托伐他汀48.58±5.77△△18.06±2.33△△513.79±37.77△△芳香新塔花总黄酮低剂量组55.60±10.75△△21.89±2.70740.79±29.57△△芳香新塔花总黄酮中剂量组53.27±7.10△△20.84±2.01△646.53±24.46△△芳香新塔花总黄酮高剂量组41.67±8.16△△19.41±2.23△△521.19±12.28△△

3.5 芳香新塔花总黄酮对动脉粥样硬化小鼠肝组织TC、TG、NEFA、FC 水平的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝组织TC、TG、NEFA、FC 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阿托伐他汀组和芳香新塔花总黄酮中、高剂量组小鼠肝组织TC、TG、NEFA、FC 水平降低（P＜0.01），芳香新塔花总黄酮低剂量组小鼠肝组织TC、TG、NEFA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），见表3。

表3 各组小鼠肝组织TC、TG、NEFA、FC 水平比较（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of mouse hepatic levels of TC，TG，NEFA and FC in each group （±s，n＝5）

表3 各组小鼠肝组织TC、TG、NEFA、FC 水平比较（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of mouse hepatic levels of TC，TG，NEFA and FC in each group （±s，n＝5）

注： 与空白组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别TC/（mmol·g prot-1）TG/（mmol·g prot-1）NEFA/（mmol·g prot-1）FC/（μmol·g-1）空白组3.16±1.2811.83±3.703.51±1.14119.28±7.25模型组12.72±2.55**31.12±4.12**7.55±1.16**281.47±42.67**阿托伐他汀5.30±1.44△△11.62±2.12△△4.39±1.40△△153.82±29.55△△芳香新塔花总黄酮低剂量组7.73±1.12△△17.30±4.96△△5.18±1.08△231.91±26.83芳香新塔花总黄酮中剂量组7.37±1.68△△17.03±1.59△△4.04±1.13△△162.78±21.35△△芳香新塔花总黄酮高剂量组5.88±1.02△△10.54±6.12△△3.34±1.34△△148.57±37.60△△

3.6 芳香新塔花总黄酮对动脉粥样硬化小鼠肝组织PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝组织PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）； 与模型组比较，阿托伐他汀组和芳香新塔花总黄酮中、高剂量组小鼠肝组织PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01），芳香新塔花总黄酮低剂量组小鼠肝组织PPARγ 蛋白表达升高 （P＜0.01），见图3。

图3 各组小鼠肝组织PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1 蛋白表达变化（±s，n＝3）Fig.3 Changes of mouse hepatic protein expressions of PPARγ，LXRα，ABCA1 and ABCG1 in each group （±s，n＝3）

4 讨论

动脉粥样硬化是内皮细胞损伤的炎症反应，也是脂质代谢紊乱引起的代谢性疾病［11］，血脂水平、炎症因子水平与斑块形成密切相关，并具有一定的预测意义［12］。肝脏作为体内脂质运转的重要枢纽，有研究发现，其在炎症细胞浸润、脂质代谢中发挥重要作用［13-14］。血脂水平作为脂质代谢紊乱的重要检测指标，其异常变化是动脉粥样硬化加重的独立、危险因素。肝脏细胞内过量的脂质沉积会引发代谢失调，释放IL-18、IL-1β、MCP-1 等炎症因子，进一步促进动脉粥样硬化的发生。IL-1β 是重要的炎症因子，可加剧炎症反应［15］，导致血管内膜增厚、血栓形成［16］。IL-18 是强大的致炎诱导剂，胡秋玲等［17］研究表明，IL-18 可上调多种炎性因子，是动脉粥样硬化形成的重要生化标志物。MCP-1 属于CC 趋化因子家族，可介导炎症反应，启动动脉粥样硬化的形成和发展［18-19］。本研究结果显示，与模型组比较，芳香新塔花总黄酮中、高剂量组小鼠血清TC、TG、LDL-C、IL-18、IL-1β、MCP-1 水平降低，HDL-C 水平升高，提示芳香新塔花总黄酮可改善血脂水平。

有证据表明，PPARγ/LXRα/ABCA1 途径在调节胆固醇外流中起着重要作用，是治疗动脉粥样硬化的新靶标［20-21］。PPARγ 是配体激活转录因子的核心家族成员，其反应元件位于LXRα 的启动子上。激活 PPARγ/LXRα 可诱导依赖 ABCA1、ABCG1 的胆固醇排出，维持胆固醇稳态，减缓动脉粥样硬化小鼠的病变面积［22-23］。肝脏脂质水平变化与动脉粥样硬化病变程度存在一定正相关性。动脉粥样硬化病变过程中，肝脏合成的TC、TG 水平升高是动脉粥样硬化的主要危险因素［24］，TC 极易沉积在动脉壁上，并随着动脉壁细胞增生形成斑块。大量TG 在肝脏中堆积是脂肪肝形成的关键因素。FC 是维持体内胆固醇平衡的重要指标，其水平失衡是促进动脉粥样硬化的重要危险因素之一。NEFA 是能量代谢的重要代谢底物，其水平与动脉粥样硬化的发展密切相关。本研究结果显示，与模型组比较，芳香新塔花总黄酮中、高剂量组小鼠肝组织脂滴面积减少，肝组织TC、TG、NEFA、FC水平降低，PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1 蛋白表达升高，提示芳香新塔花总黄酮可激活PPARγ/LXRα/ABCA1 通路改善肝脏脂质沉积。

综上所述，芳香新塔花总黄酮可抑制炎症反应和肝脏脂质蓄积进而改善动脉粥样硬化，其机制可能与激活PPARγ/LXRα/ABCA1 通路有关。课题组后续将开启体外实验继续深入验证，探究芳香新塔花总黄酮调控PPARγ/LXRα/ABCA1 通路与抑制肝脏脂质代谢之间是否存在更深层次的关联。