李 丽，袁 航，郭绪生，吴爱英，陈安珍，刘红兵，卢京光，3*

（1.中国海洋大学，山东 青岛 266000； 2.国家药品监督管理局海洋中药质量研究与评价重点实验室，山东 青岛 266000； 3.青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266000）

寒热痹胶囊由白芍、麻黄、甘草等10 味中药组成，具有散寒清热、和营定痛作用［1-2］，主要用于治疗风湿病中的寒热错杂证［3］，而且无明显不良反应，是一种安全有效的抗风湿病药物。该制剂质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》 中药成方制剂第十九册［4］，但只有麻黄TLC鉴别、胶囊通用检查，缺少成分含量测定，很难对其内在性质进行全面把控，从而无法充分反映其质量。目前，国内对寒热痹胶囊质量的研究很少，文献［5-6］ 也只对单一成分进行含量测定，而且效率低，成本高。

一测多评法是一种能满足中药多成分特性的质量评估方法［7-9］，可节约时间，降低成本，目前已收载于各国药典［10］，而且在多种中药材、中药饮片、中药制剂含量测定研究中得到广泛应用［11-17］，但尚未涉及寒热痹胶囊。因此，本实验建立一测多评法同时测定寒热痹胶囊中没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵的含量，以期为进一步评价该制剂质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置DAD 检测器（美国安捷伦公司）； LC-2030C 高效液相色谱仪，配置PDA 检测器（日本岛津公司）；超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；BP211D 电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试剂 没食子酸（批号110831-201906，纯度91.5%）、盐酸麻黄碱（批号171241-201809，纯度100%）、盐酸伪麻黄碱（批号171237-201510，纯度99.8%）、芒果苷（批号111607-201704，纯度98.1%）、芍药苷 （批号110736-202145，纯度94.6%）、甘草酸铵 （批号110731-202021，纯度96.2%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷 （批号 MUST-21031601，纯度≥99.14%）、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖（批号MUST-21092610，纯度≥99.14%） 对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）； 其他试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材与药物 桂枝、白芍、防风、知母、白术、麻黄、干姜、附子（炙）、甘草、地龙药材均购自市场，经青岛市食品药品检验研究院吴爱英主任中药师鉴定为正品。寒热痹胶囊共10 批，均由长春英平药业有限公司生产，编号S1～S10。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1% 磷酸 （B），梯度洗脱 （0 ～8 min，4.5% A； 8 ～9 min，4.5% ～12% A； 9 ～17 min，12%A； 17 ～30 min，12% ～47% A； 30 ～33 min，47% ～52%A； 33 ～35 min，52% ～70%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长0 ～8 min 210 nm （没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱），8～17 min 235 nm （芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷），17 ～27 min 216 nm （1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖），27～35 min 254 nm （甘草酸铵）；进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵对照品适量，70%甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为202.032、217.800、213.372、35.128、207.996、750.746、419.560、414.814 μg/mL 的贮备液，精密量取适量，70%甲醇稀释，即得（各成分质量浓度分别为 22.377、8.712、8.535、2.810、33.279、60.060、16.782、16.593 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液 取本品10 粒，倾出内容物研细，取约0.4 g，精密称定，置于50 mL 量瓶中，加入40 mL 70%甲醇，超声（功率240 W，频率40 kHz） 处理30 min，冷却，70% 甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方比例和工艺，分别制成缺白芍、缺麻黄、缺知母、缺甘草的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，杂质不会干扰待测成分，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，70%甲醇稀释，制成6 个质量浓度，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵峰面积RSD 分别为0.27%、0.45%、0.52%、0.46%、0.90%、0.30%、0.39%、0.28%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份本品（批号S10），于0、4、8、12、18、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵峰面积RSD 分别为0.23%、0.35%、1.12%、1.54%、0.75%、0.44%、0.98%、0.20%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取本品（批号S10） 6 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵峰面积 RSD 分别为 0.89%、0.64%、0.55%、0.87%、0.76%、0.86%、1.76%、0.73%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品（批号S10） 6 份，每份约0.2 g，精密称定，置于50 mL 量瓶中，按100%水平精密加入对照品溶液（没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵质量浓度分别为0.202 0、0.217 8、0.213 4、0.035 13、1.053 9、0.841 2、0.212 6、0.414 8 mg/mL） 适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵平均加样回收率分别为 95.53%、99.24%、102.93%、104.81%、101.47%、103.45%、103.20%、100.33%，RSD 分别为 1.84%、2.04%、2.57%、1.54%、1.60%、2.17%、0.84%、2.52%。

2.4 相对校正因子计算 分别取“2.2.1” 项下对照品溶液1、3、5 μL，各3 份，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以芍药苷为内标，计算相对校正因子fk/s，公式［18］为fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子（n＝3）Tab.2 Relative correction factors of various constituents （n＝3）

2.5 耐用性考察

2.5.1 仪器、色谱柱 本实验分别在Agilent 1260、LC-2030C 色谱仪，以及Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Waters CORTECS C18（100 mm × 4.6 mm，2.7 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm） 色谱柱上计算相对校正因子，结果见表3，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响（n＝3）Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors （n＝3）

2.5.2 柱温 本实验分别在33、35、37 ℃下计算相对校正因子，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表4 不同柱温对相对校正因子的影响（n＝3）Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors （n＝3）

2.5.3 体积流量 本实验分别在0.9、1.0、1.1 mL/min 下计算相对校正因子，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜4%）。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响（n＝3）Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors （n＝3）

2.6 色谱峰定位 本实验分别计算在“2.5.1”项仪器、色谱柱上的相对保留时间、保留时间差，结果见表6～7。由此可知，各成分保留时间差波动较大，而相对保留时间波动较小，故选择后者作为色谱峰定位标准。

表6 各成分相对保留时间Tab.6 Relative retention time of various constituents

表7 各成分保留时间差Tab.7 Retention time differences of various constituents

2.7 样品含量测定 取10 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表8，可知2 种方法所得结果接近。

表8 各成分含量测定结果（mg/g）Tab.8 Results of content determination of various constituents （mg/g）

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验先以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，发现乙腈-0.1%磷酸洗脱时各成分色谱峰分离度、对称因子均良好，再进行190 ～400 nm 全波长扫描，根据各成分最大吸收波长，最终确定在210 nm 处检测没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱，235 nm处检测芒果苷、芍药苷、芍药苷，216 nm 处检测1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖，254 nm 处检测甘草酸铵。

3.2 供试品溶液制备方法选择 本实验分别考察了不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、稀乙醇、70%乙醇）、提取方式（超声、加热回流）、提取时间（15、30、45 min），以各成分含量为评价指标，综合考虑检测时间、成本及操作便利性，最终确定70%甲醇超声处理30 min 作为供试品溶液制备方法。

3.3 内标选择 选择内标时，应遵循性质稳定、价廉、易得、低毒、有效的原则［19］。本实验发现，芍药苷化学性质稳定［20-21］，含量高，无毒，对照品廉价易得，故以其为内标。

3.4 含量分析 10 批样品中均可检出8 种成分，其中S1 样品中各成分含量与其他批次样品存在一定差异，可能与药材质量、生产工艺有关。

3.5 耐用性分析 本实验考察了不同仪器、色谱柱、柱温对相对校正因子的影响，并对同一色谱条件下的相对保留时间进行研究，发现相对校正因子重复性理想，相对保留时间定位色谱峰波动较小，表明该方法稳定性良好。

4 结论

本实验建立一测多评法同时测定寒热痹胶囊中没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芒果苷、芍药内酯苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、甘草酸铵的含量，不仅能降低实验成本，还可提高工作效率，从而为该制剂多成分含量测定提供新的思路和模式，使其质量评价更具有科学性。