骆阳，徐兴伟，嵇武

1 南京医科大学金陵临床医学院 东部战区总医院普外科，南京 210002；

2 浙江大学医学院附属第一医院结直肠外科

随着二代测序技术的不断发展，人们在肠道微生物组中发现了除细菌以外的另一重要组群的存在，即共生真菌组。共生真菌多样性及丰度的改变已被证明与多种疾病相关，例如炎症性肠病、结直肠癌、抗生素相关性腹泻、肠易激综合征以及过敏性鼻炎等［1-5］。作为一种机会性致病菌，共生真菌在机体免疫功能低下、药物干预等多种情况下可引发疾病。对于肠道而言，定植在肠道的共生真菌会损害并突破肠黏膜屏障发生菌群易位，引发肠道炎症反应，甚至侵入循环系统，造成播散性真菌病。白色念珠菌作为肠道共生真菌的优势菌群，其群落形态、丰度的改变可随机体免疫状态而发生变化，可通过形成菌丝体、分泌念珠菌溶素及分泌细胞外囊泡（EVs）等多种机制损伤机体上皮细胞、内皮细胞以及各种免疫细胞，从而导致疾病发生。然而，目前对白色念珠菌通过何种方式引发疾病以及疾病的进展又如何影响真菌多样性和丰度变化的认识依旧不够全面，导致临床治疗手段也较为局限。因此，深入探究白色念珠菌的致病机制对于进一步认识真菌，探寻新的治疗方法具有重要意义。现就白色念珠菌致病机制研究进展综述如下。

1 白色念珠菌通过形成菌丝体导致疾病发生

白色念珠菌具有分化成多种形态的能力，其分化形态包括但不限于单细胞酵母、假菌丝、菌丝、生物膜状态以及独特的孢子形态，不同状态的白色念珠菌具有独特的生物学作用。白色念珠菌发生形态转变的基础是其独特的细胞壁组成。白色念珠菌的细胞壁具有两层结构，内层由几丁质、β-1，3-葡聚糖及β-1，6-葡聚糖组成，外层是富含N-或O-连接的甘露聚糖修饰的蛋白质，称为甘露糖蛋白［6］。在机体免疫功能正常时，大部分白色念珠菌以酵母形态黏附在肠黏膜上，此时低表达毒力因子，主要对机体的免疫系统起到塑造作用，代表着与机体共生适应［7］。而当受到各种刺激或生存环境改变时，白色念珠菌会从酵母状态转变为菌丝状态，可造成组织入侵及免疫逃避［8］。因此，普遍认为丝状化是白色念珠菌的主要毒力特性之一。与白色念珠菌菌丝形成相关的基因包括ADH1、ALS3、BMH1、RBT1、UBP8、UME6 及UTR2 等［8-10］。cAMP-PKA 通路被认为是白色念珠菌丝状化的主要信号通路，并多次在体外试验中被证实。但PARRINO 等［11］通过体外构建了缺乏腺苷酸环化酶（AC）的假回复白色念珠菌株，发现缺乏AC 的部分白色念珠菌能够以不依赖cAMP 的方式完成丝状化。同样的，WAKADE 等［12］在体内实验中也证实AC 缺失的白色念珠菌依旧能够顺利完成丝状化。这提示白色念珠菌丝状化是极其复杂的过程，有多条信号传导通路。一般认为，完成丝状化的白色念珠菌通过菌丝以物理方式刺破吞噬体的细胞膜，但也有学者提出，菌丝形成只是白色念珠菌杀死吞噬细胞的形态基础，暴露的菌体细胞壁糖基化蛋白诱导吞噬体程序性死亡启动，是触发宿主细胞死亡的更深层机制，并最终完成免疫逃逸造成播散［13］。

2 白色念珠菌通过分泌念珠菌溶素导致疾病发生

念珠菌溶素是由MOYES 等［14］于2016 年在白色念珠菌中发现的第一种真菌溶细胞肽毒素，其是白色念珠菌的致病因子之一。念珠菌溶素是由基因ECE1编码翻译后的产物，ECE1呈α-螺旋并包含7个KR（赖氨酸—精氨酸）位点，首先经过蛋白内切酶Kex2p 切割加工产生未成熟的念珠菌溶素，然后由羧肽酶Kex1p 进一步去除C 末端的精氨酸，形成有活性的成熟念珠菌溶素［14］。

念珠菌溶素可通过多种方式导致细胞坏死。BLAGOJEVIC 等［15］研究发现，白色念珠菌菌丝可与上皮细胞顶端膜接触形成凹陷的“侵入袋”，有利于念珠菌溶素的聚集，其C末端带正电荷的KR残基能够与质膜上带负电荷的成分相互作用并成孔，以Ca+内流的方式造成胞内线粒体膜去极化并失活破裂，释放大量活性氧，导致上皮细胞坏死并引发炎症反应。HO 等［16］发现，在Ca+内流和基质蛋白酶MMP 的协助下，念珠菌溶素可能通过EREG、EPG 和AREG等配体激活表皮生长因子受体，接着激活下游MAPK 信号传导，释放大量粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子，募集中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞聚集，从而引发局部炎症反应。SWIDERGALL 等［17］研究表明，念珠菌溶素能够通过MEK1/2 及ERK1/2诱导MAPK 信号传导，导致AP-1 转录因子 c-Jun/c-Fos 激活并上调中性粒细胞募集趋化因子CXCL8的分泌，导致大量中性粒细胞募集至感染部位，引发过度的炎症反应，造成血管内皮细胞损伤。而被巨噬细胞吞噬的白色念珠菌也可通过念珠菌溶素促使巨噬细胞K+外流，激活NLRP3 炎症小体，介导白细胞介素1β（IL-1β）大量分泌，进而引发巨噬细胞肿胀破裂，作为白色念珠菌逃避吞噬的机制之一［18］。

当白色念珠菌随血流播散至肠外时，可能引发更为严重的疾病。近年来发现，白色念珠菌与过敏性哮喘之间存在极为密切的关联。WU 等［5］研究发现，念珠菌溶素能够通过VWF受体GP1bα激活血小板以释放Wnt 拮抗剂Dkk-1，启动依赖Th2 和Th17细胞的抗真菌反应，但当这种真菌感染不能及时控制时，就会引发哮喘等严重过敏反应。念珠菌属的大部分菌种都能够分泌念珠菌溶素，但不同菌种分泌的念珠菌溶素也存在差异。RICHARDSON 等［19］发现，都柏林念珠菌和热带念珠菌分泌的念珠菌溶素也是一种由ECE1 编码的α-螺旋肽毒素，但引起Ca+内流造成上皮损伤的能力比白色念珠菌更强。同时，该研究团队认为可以把念珠菌溶素看作一个新的功能活性肽毒素家族，作为人类致病真菌中第一个溶细胞肽毒素家族。

3 白色念珠菌通过分泌EVs导致疾病发生

EVs是由各种组织和细胞分泌的被脂质双层膜所包裹的膜囊泡总称，其中包含各种蛋白质、脂质、聚糖、核酸以及mRNA 等生物活性物质［20］。美国科学家ANDERSON 在1990 年首次通过电镜技术观察到白色念珠菌分泌的一种不透明丘疹样囊泡，并发现囊泡中的酸性蛋白酶是白细胞的10 倍以上。但限于当时的技术，无法对囊泡结构、功能和分泌机制展开深入研究。直到2008 年人们发现白色念珠菌分泌的囊泡与其他子囊菌一样，都属于EVs。随着研究的深入，学者们逐渐揭示了白色念珠菌EVs 的组成和功能，并且发现EVs 是白色念珠菌的致病因素之一。

VARGAS 等［21］在两种白色念珠菌菌株ATCC 90028、ATCC 11 分泌的EVs 中共鉴定出57 种蛋白，分布上，64%的蛋白定位于细胞壁和细胞质；功能上，24%的蛋白与致病相关，23%的蛋白与脂质、糖和蛋白质等代谢相关，22%的蛋白与细胞组织和生物发生相关。该研究还通过高效薄层色谱法对EVs的脂质成分进行鉴定，发现麦角甾醇、中性鞘糖脂和葡糖神经酰胺（G1cCer）为主要成分，而G1cCer 最近被发现为白色念珠菌的关键毒力因子。GIL-BONA等［22］在白色念珠菌分泌的EVs 中共鉴定出75 种蛋白，其中53%与细胞壁和跨膜蛋白相关，如甘露糖蛋白Mp65、黏附样蛋白Sim1、细胞壁糖苷酶Sun41、Tos1、Scw11、Xog1 及几丁质酶Cht3，提示EVs 的分泌与菌体细胞壁的关系十分密切。内吞体运输必需分选复合物（ESCRT）是一类与细胞中膜结构重构有关的重要蛋白复合物，在膜蛋白降解、信号传导、病毒出芽、细胞分裂、膜损伤修复等诸多重要过程中发挥作用。而ZARNOWSKI 等［23］研究发现，ESCRT 对于真菌EVs从胞内到胞外的转运有重要作用。

为了更好地模拟疾病状态下宿主—病原体相互作用，KONEČNÁ 等［24］在营养有限（缺乏氨基酸）的培养基上种植白色念珠菌（ATCC 90028和一例临床患者分离出的菌株），检测到3 种只存在于ATCC 90028 菌株中的毒力相关蛋白：凝集素样蛋白3（Als3）、分泌型天冬氨酸蛋白酶8（SAP8）和细胞表面超氧化物歧化酶铜—锌6（SOD6），而相较于在营养丰富情况下培养的菌株ATCC 90028，SAP 家族蛋白只在营养物质匮乏的环境中发现，这提示营养条件改变会影响真菌EVs 的组成。MARTÍNEZLÓPEZ 等［25］对比分析了白色念珠菌（ATCC SC5314）菌丝态与酵母态EVs 的差异，虽然酵母态EVs（YEVs）体积普遍大于菌丝态EVs（HEVs），但HEVs中包含的蛋白远多于YEVs，在HEVs 中鉴定出的1 598 种蛋白，其中大部分与细胞壁组成、蛋白转运和代谢蛋白相关，这可能是为了更好地黏附免疫细胞进而与之相互作用。并且，研究者还在HEVs 中发现了一种独特的20 S 蛋白酶体复合物，这种复合物具有高度水解酶的活性，同样也提示菌丝态的菌株具有高度侵袭性和致病性。以上研究表明，白色念珠菌在不同环境中、不同形态下分泌的EVs，其组成和功能具有高度差异性。

白色念珠菌分泌的EVs 具有免疫原性，能够引起机体免疫细胞分泌多种细胞因子。巨噬细胞在吞噬EVs后，产生大量一氧化氮、IL-1、转化生长因子β（TGF-β）及IL-10 等炎症因子。同样，经EVs 处理后的树突样细胞（DC），IL-12、IL-10、TGF-β 及肿瘤坏死因子α 的合成显著增加，EVs 还可诱导DC 表面CD86 和主要组织相容性复合物Ⅱ的上调［20］。一项研究使用蛋白酶K、核酸酶及核糖核酸酶A 水解马尔尼菲篮状菌分泌的EVs，发现只有蛋白酶K 水解后的EVs与免疫细胞作用后未能引起上述炎症因子的释放［26］。虽然没有关于白色念珠菌此方面的研究，但我们可以推测EVs 中包含的大量蛋白质是与宿主免疫细胞作用的主要成分。

此外，HALDER 等［27］发现，白色念珠菌亦可利用单核细胞分泌的EVs 来减轻机体免疫反应，从而逃避吞噬。白色念珠菌细胞壁中β-葡聚糖通过与单核细胞膜上的补体受体b3（CR3）结合，诱导单核细胞TGF-β1转运EVs 的产生，包含TGF-β1的EVs 可结合其他单核细胞上的TGF-βRⅡ，增加SMAD2/3磷酸化，上调SMAD7 及下游NF-κB 抑制剂的表达，导致促炎因子IL-1β 表达减少。同时，包含TGF-β1的EVs还可与内皮细胞上的TGF-βRⅡ结合，上调包括TGF-β1在内的多种抗炎因子，从而进一步放大信号，发挥抗炎作用，减轻免疫反应，有利于白色念珠菌的存活及逃逸。该研究团队在后期实验中再次发现白色念珠菌细胞壁上β-葡聚糖与甘露聚糖可分别结合单核细胞上的CR3 及TLR4 受体，进而导致单核细胞分泌包含has-miR-24-3p 的EVs，同时白色念珠菌通过C3b/iC3b与EVs 表面的CR1 结合，利用EVs 中的has-miR-24-3p 抑制自身细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白SOL1 mRNA翻译，从而导致白色念珠菌大量生长并丝状化［28］。由上可见，白色念珠菌不仅可以通过自身分泌包含大量致病蛋白的EVs导致机体严重炎症反应，还可以诱导一些免疫细胞分泌有利于自身生长的EVs 从而躲避免疫，增加感染风险。

综上所述，白色念珠菌可通过形成菌丝体、分泌念珠菌溶素及分泌EVs 等多种机制导致疾病发生。多种信号传导通路导致菌丝状态的白色念珠菌是其与机体内细胞相互作用并分泌念珠菌溶素、细胞外囊泡等毒力因子的基础。由此引发了我们的思考：是否可以通过药物靶向抑制白色念珠菌菌丝形成转导信号通路，在致病源头对其进行控制；念珠菌溶素作为一种毒素，是否可以研制中和毒素的血清，减轻炎症反应；EVs中包含大量菌体相关蛋白，是否可以分离出囊泡中的致病蛋白抗原，制备免疫制剂预防真菌感染。SINGH 等［29］研究发现，在大鼠体内接种白色念珠菌细胞壁蛋白ALS3、HYR1 抗原制剂后再次感染白色念珠菌的病死率显著降低，虽然此方法应用于临床患者依然还需克服诸多困难，但动物实验取得的初步成功至少证明了理论的可行性。