蒋红芝，义崇宽，尹翠莹

（广西农业职业技术大学，广西 南宁 530007）

单宁是一类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物，其结构复杂，已被证实具有多种功效，比如抗氧化作用，能有效预防高血脂、高血糖、心脑血管等慢性疾病[1]。荔枝属植物荔枝的果实。我国是荔枝生产大国，主要荔枝产地为广东、福建、广西、海南。荔枝在食药、营养保健、纺织染整等领域广泛应用，比如单宁与铁、铜、铝金属离子结合可生成有色络合物，用于羊毛、蚕丝等蛋白质染色[2-3]。

荔枝皮目前尚未得到有效利用。荔枝皮含有多酚物质（单宁），为主要功能成分之一。纯化单宁的方法有溶剂萃取法、沉淀分离法、大孔树脂吸附法、膜分离技术等[4]。其中，大孔树脂吸附法具有生产效率高、成本低且操作简单方便、选择性好、吸附容量大、大孔树脂可再生重复利用等优点，被广泛应用于工业化制备天然产物中[5]。笔者对荔枝皮中单宁的纯化工艺进行研究，采用紫外-可见分光法测量荔枝皮中单宁的含量，利用大孔树脂吸附对荔枝皮浓缩液中的单宁进行分离和纯化，筛选出性能较优的大孔树脂[6]，为实现荔枝皮资源的综合利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

原料：桂味荔枝经自然晒干的荔枝皮。

材料：单宁酸（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司），无水乙醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司），AB-8 大孔吸附树脂、D101 大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技发展有限公司），NKA-9 大孔吸附树脂、ADS-21 大孔吸附树脂、HPD826 大孔吸附树脂（上海一基实业有限公司）。

仪器与设备：AS 220.R2 电子天平（苏州培科实验室仪器科技有限公司）、高速多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）、KQ5200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、SHB—Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、TopPette 手动单道可调移液器[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司]、TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、SB-5200D 超声波清洗仪（宁波新艺超声设备有限公司）、DBS-100 电脑全自动部份收集器（上海沪西分析仪器厂有限公司）、HB-2B 恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）、RE-2000B 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 单宁标准曲线和含量测定

准确称取单宁0.0500±0.0001g，用纯化水定容至100mL，配制成500μg/mL 单宁贮备液。精确量取不同体积的贮备液0mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL 置于50mL 容量瓶中，用纯化水定容，摇匀，选取0.25mL 稀释到50mL 的溶液在200～400nm扫描吸收曲线，获得最大吸收波长。在最大吸收波长处测定标准系列的吸光度，绘制标准曲线[7]。

取晒干的荔枝皮，粉碎至细粉。参照前期研究的荔枝皮单宁最佳提取工艺[3]，精密称定荔枝皮粉，按料液比1∶40，加入70%乙醇（体积分数），浸泡20min 后，放入45℃的超声波清洗仪中提取40 min，冷却后进行抽滤，记录提取抽滤液的体积。采用60℃减压浓缩，得荔枝皮浓缩液，稀释后测定吸光度A，计算单宁的含量，见公式（1）。

式中：m 为浓缩液中单宁的质量，μg；c 为提取液稀释后的浓度，μg/mL；V 为浓缩液的体积，mL；n 为稀释倍数。

单宁的吸附量、吸附率计算见公式（2）、公式（3）。

式中：me为吸附平衡后溶液中的单宁量，μg；ce为吸附平衡后溶液中单宁的浓度，μg/mL；V 为吸附平衡后剩余溶液的体积，mL；n 为稀释倍数；m0为吸附前溶液中的单宁量，μg。

1.2.2 大孔树脂分离纯化

柱层析分离纯化的工艺流程为：吸附树脂预处理→大孔树脂装柱→平衡→添加荔枝皮单宁浓缩液→树脂吸附单宁→用洗脱溶剂洗脱→收集洗脱液→稀释后测定吸光度→吸光度乘以稀释倍数后绘图[8]。

1.2.2.1 大孔树脂的预处理

先用95%乙醇浸泡大孔树脂24 h，使其充分溶胀，适当搅拌使大孔树脂充分接触，以便赶出孔中的空气[6]，然后将大孔树脂装柱，用95%乙醇冲洗，直至洗出液加适量纯化水后无白色浑浊现象出现，最后用纯化水洗至没有乙醇即可使用。

1.2.2.2 最佳树脂的筛选

分别称取2.00g 预处理过的型号为ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔树脂，加入荔枝皮单宁提取液的浓缩液5mL，室温下静置吸附一定时间后取上清液测定吸光度，吸光度小则说明吸附好。

1.2.2.3 大孔树脂静态吸附和洗脱

分别称取10.00g 预处理过的型号为ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔树脂[7]置于5 个烧杯中，加入荔枝皮浓缩液10.00mL，在室温下吸附30min、60min 后取上清液测定吸光度，至达到吸附平衡为止，计算吸附率。据此选择出吸附效果好的树脂。

从已充分吸附荔枝皮浓缩液的5 种型号的树脂中分别称取2.00g 各3 份，加入不同体积分数（50%、70%、90%）的乙醇溶液5mL，洗脱30min、60min、80min，分别测定上清液的吸光度，计算洗脱率。据此选择出洗脱效果好的树脂。

1.2.2.4 大孔树脂动态吸附和洗脱

分别称取25.00g HPD826、ADS-21 预处理过的树脂置于2 个烧杯中，加入荔枝皮的浓缩液25.00mL，在室温下的超声波清洗器中进行振荡吸附30min、60min后测定上清液的吸光度[9]。用90%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定吸光度。

1.2.2.5 柱层析吸附和洗脱

将静态吸附试验筛选出的大孔树脂HPD826、大孔树脂ADS-21 分别装柱（湿法装柱），量取荔枝皮浓缩液25.00mL，吸附1h，用纯化水洗3 次。再用90%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定吸光度。考察洗脱溶剂用量对洗脱率的影响[10]。洗脱率计算公式见公式（4）。

式中：ma为洗脱的质量，μg；m0为吸附前溶液中的单宁量，μg；me为吸附平衡后溶液中的单宁量，μg。

2 结果与分析

2.1 单宁酸定性和定量结果

2.1.1 单宁酸的最大吸收波长和标准曲线方程

从单宁酸扫描曲线得到最大吸收波长为276nm。在276nm 下测定标准溶液的吸光度A，绘出c-A 标准曲线，得线性回归方程c=28.849A+2.4219。标准单宁酸浓度c 在0～30.00μg/mL 范围内与A 呈良好的线性关系。

2.1.2 荔枝皮单宁最大吸收波长

用70%乙醇提取荔枝皮中的单宁，提取液色泽为暗红色，提取液减压浓缩，回收乙醇。取浓缩液0.15mL 并稀释成50mL，扫描曲线得最大吸收波长为278nm。其处于单宁酸最大吸收波长276±2nm 范围内，故荔枝皮提取液中含有单宁。分别测定提取液、浓缩液稀释后的吸光度，计算出对应的单宁含量，数据见表1。

表1 不同提取液、浓缩液中单宁的含量

2.2 最佳吸附树脂类型的筛选

分别称取2.00g 预处理过的型号为ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔树脂，分别加入荔枝皮单宁提取液的浓缩液5mL，室温下静置吸附一定时间后，测定上清液的吸光度。影响大孔树脂吸附性能的因素包括孔径和比表面积等，孔径大小影响被吸附物质的扩散，比表面积大小影响吸附物质的量[11]。通过静态吸附后，取上清液2mL 稀释至50mL，用5 种树脂吸附60min 后，测定吸光度，计算吸附率。吸附率结果见图1。

图1 不同型号的大孔树脂对荔枝皮单宁的吸附效果

数据表明，大孔树脂对荔枝皮单宁的吸附率由大到小顺序为NKA-9 >ADS-21 >HPD826 >D101 >AB-8。显然，NKA-9 大孔树脂吸附效果最好，其次分别是ADS-21 大孔树脂、HPD826 大孔树脂。

2.3 洗脱剂溶液浓度的选择

吸附荔枝皮单宁的大孔树脂洗脱率见表2，表2中的洗脱率数据取4 位有效数字。

表2 溶剂对荔枝皮单宁的洗脱率影响

数据表明，5 种类型树脂各自的洗脱率极高值集中在体积分数为90%的乙醇中处理30min，而5 种类型树脂在体积分数为50%的乙醇中处理30min 也能相应得到较好的洗脱率。

HPD826 在90%乙醇中洗脱30min 时，洗脱率为5种类型树脂全部测试数据的最高值16.13%，说明其洗脱效果最好。在90%乙醇中洗脱30min 时，ADS-21 洗脱率为13.77%；在90%乙醇中洗脱30min 时，D101 洗脱率达15.70%，但其洗脱60min 后降为13.56%。结合图1 的吸附率数据看，NKA-9 的大孔树脂吸附效果比较好但洗脱效果差。经综合比较后认为，HPD826、ADS-21 的吸附率、洗脱率均较好，故后续选择HPD826、ADS-21 做大样试验。而洗脱溶剂选择体积分数为90%的乙醇洗脱效果较好。

2.4 大孔树脂的静态吸附和洗脱结果

2.4.1 静态吸附结果

分别称取10.00g 预处理过的型号为ADS-21、HPD826、AB-8、NKA-9、D101 的大孔树脂置于5 个烧杯中，加入荔枝皮的浓缩液10.00mL，在室温条件下静置吸附60min 后，取上清液测定吸光度A。各树脂的静态吸附率见图2。静态吸附率由大到小的顺序为ADS-21 >NKA-9 >D101 >HPD826 >AB-8，ADS-21 的吸附率为89.15%，吸附效果最好，其次是NKA-9 的吸附率为82.18%，D101 的吸附率为77.02%。

图2 不同树脂的静态吸附率

2.4.2 静态洗脱结果

选择90%乙醇进行洗脱，分别洗脱30min、60min、80min 后，取上层清液1mL 稀释至50mL，测定吸光度，计算洗脱率。不同树脂的静态洗脱率见图3。由图3 可知，各树脂随着洗脱时间的延长，洗脱率均有所下降，但是下降的趋势各不相同。例如，洗脱30min 时，HPD826和D101 的洗脱率相对其他树脂较高，而洗脱60min时，D101 和ADS-21 的洗脱率相对其他树脂较高。

图3 90%乙醇不同树脂静态洗脱率

2.5 大孔树脂的动态吸附和洗脱结果

2.5.1 HPD826 动态吸附和洗脱结果

称取2 份25.00g HPD826 预处理过的树脂置于2个烧杯中，加入荔枝皮的浓缩提取液25.00mL。一份在室温下用超声波清洗器振荡吸附30min、60min 后测定上清液的吸光度，30min 的吸光度为0.334，60min 的吸光度为0.170。另一份在柱层析上吸附，25.00mL 反复吸附3 次约0.5h，静置0.5h，合计1h 后洗净，测定上层清液的吸光度。2 份试样再分别用柱层析洗脱，结果见图4。由图4 可见，HPD826 大孔树脂柱层析吸附的洗脱峰较高和较窄，柱层析吸附比超声波吸附的吸附效果好。

图4 HPD826 大孔树脂动态洗脱曲线

2.5.2 2 种树脂动态洗脱对比

HPD826、ADS-21 柱层析动态洗脱液峰值曲线见图5。由图5 可见，荔枝皮浓缩液经过HPD826、ADS-21 这2 种大孔树脂吸附、柱层析动态洗脱分离后较集中在1 个洗脱峰。HPD826 大孔树脂吸附柱层析的洗脱峰比较窄，洗脱下来的单宁相对比较集中，即分离洗脱的效果比较好。HPD826 大孔树脂洗脱效果优于ADS-21 大孔树脂。HPD826、ADS-21 2 种树脂均可以用作荔枝皮单宁的分离纯化。

图5 HPD826、ADS-21 柱层析动态洗脱液峰值曲线

3 结论

（1）荔枝皮中单宁的提取参照荔枝皮单宁的最佳提取工艺进行，提取液经浓缩后得浓缩液。

（2）不同型号的大孔树脂对荔枝皮浓缩液中单宁的吸附和洗脱效果有所不同。NKA-9、ADS-21、HPD826 吸附效果较好；90%乙醇洗脱效果最好；综合吸附及洗脱效果，筛选出了对荔枝皮单宁分离纯化效果较好的大孔树脂HPD826、ADS-21，二者吸附率分别为76.57%、89.15%，洗脱率分别为16.13%、13.77%。ADS-21 的吸附效果优于HPD826，但从洗脱效果看，HPD826 优于ADS-21。

（3）HPD826 树脂分离纯化荔枝皮单宁的工艺参数为：上柱流速为匀速，质量浓度为3828.5μg/ml，洗脱剂为90%乙醇（体积分数）。

（4）荔枝皮浓缩液中单宁经大孔树脂吸附、90%乙醇洗脱后，再经浓缩、真空干燥后可得固体单宁。