尹珊珊 马 红 姜 琦 （青海红十字医院小儿内科，西宁 810000）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种复杂的气道疾病，临床较为常见，其特征为慢性炎症、气道高反应性和气道重塑，具有较高的发病率及病死率，已严重威胁全球人民的健康和生活［1］。气道重塑是哮喘气道高反应性和肺功能障碍的主要原因，TGF-β1是一种在哮喘患者气道中增多的生长因子，其失调对于气道重塑至关重要［2-3］。据报道，TGF-β1 水平升高可促进哮喘中支气管上皮细胞和气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖，参与哮喘患者气道重塑［4-5］，故TGF-β1 为降低哮喘发病率和病死率的潜在治疗靶点。此外，氧化应激功能障碍是气道重塑的另一个关键触发因素。已有研究证实氧化应激会增强TGF-β1 诱导的ASMCs 细胞活力，抗氧化调节已成为近年来哮喘研究的热点［6］。作为一种有效的抗氧化因子，核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf-2）水平与哮喘进展密切相关［7］；血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）是Nrf-2 的重要靶基因，具有抗炎和抗氧化特性，Nrf-2/HO-1 通路的激活可减弱气道重塑［8］。因此，靶向氧化应激也是气道重塑介导的哮喘的潜在治疗策略。

白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）为白芍的有效部位，具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗氧化和免疫调节［9-10］。TGP 在中国已被广泛应用于治疗自身免疫性疾病，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、过敏性接触性皮炎等，是一种有前景的抗炎和免疫药物［9，11-12］。研究显示，TGP可下调TGF-β1表达，抑制心肌重构［13］；还可显著提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，对抗氧化应激，防止糖尿病相关的肾损伤［14］。然而TGP 是否能抑制哮喘小鼠的气道重塑还未可知。因此，本研究采用卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）诱导建立小鼠支气管哮喘模型，探究TGP 对模型小鼠气道重塑的影响及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 从北京维通利华实验动物技术有限公司购入SPF 级雄性BALB/c 小鼠50 只，6～7 周龄，体质量18～22 g，饲养于恒温室，动物房温度保持在（24±3） ℃，相对湿度40%～60%，并在可控制的光照下保持12 h/12 h 明暗交替。该研究得到青海红十字医院动物护理和使用委员会的批准（202109001），并按照实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。适应性饲养7 d后开始实验。

1.1.2 主要试剂与仪器 白芍总苷胶囊（帕夫林，宁波立华制药有限公司，国药准字：H20055058，规格0.3 g）；OVA（Sigma-Aldrich，A21772）；Nrf-2 抑制剂ML385（北京百奥莱博科技有限公司，M00240）；HE 染色试剂（C0105）、RIPA 裂解液（P0013B）、BCA试剂盒（P0010）均购自碧云天生物科技公司；AB-PAS染色试剂盒（G1285）购自北京Solarbio 公司；小鼠半胱 氨 酰 白 三 烯1（cysteinyl leukotriene 1，CysLT1）（ml058762）、TGF-β1（ml002115）ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；小鼠半胱氨酰白三烯受 体1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）ELISA 试剂盒（KT-34072）购自美国Kamiya Biomedical 公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）检测试剂盒（比色法，A015-1-2）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（比色法，A005-1-2）、SOD（WST-1 法，A001-3-2）、CAT（A007-2-1）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TRIzol（9108-1）、PrimeScriptTMRT 试剂盒（RR037A）、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（RR820A）购自日本TaKaRa；TGF-β1、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）和金属蛋白酶组织抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）的引物购自上海GenePharma 公司；兔源一抗TGF-β1（ab215715）、Nrf-2（ab137550）、HO-1（ab189491）、Lamin B1（ab16048）、GAPDH（ab181602）和二抗羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718）购自英国Abcam公司。

iMark680 多功能酶标仪、蛋白转膜装置（美国Bio-Rad 公司）；NanoDrop 2000 分光光度计（美国Thermo Scientific 公 司）；ABI 7500 实 时 荧 光 定 量PCR 仪（美国应用生物系统公司）；IX71 荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备 将50 只BALB/c 小鼠随机分为对照组（Control 组）、模型组（OVA 组）、TGP低剂量组（TGP-L，460 mg/kg）、TGP高剂量组（TGP-H，920 mg/kg）、TGP+ML385 组（TGP 920 mg/kg+ML385 30 mg/kg）［15］，每组10 只。除Control 组外，其余各组小鼠参考文献［16］方法采用OVA 致敏建立哮喘模型：分别在实验第1 天、第7 天腹腔注射0.2 ml OVA致敏液（4 mg OVA+150 µl 氢氧化铝），从第21 天开始将小鼠置于雾化箱内使用10%OVA 激发液（20 g OVA+200 ml 生理盐水）进行雾化，每周3 次，每次30 min，连续8 周；Control 组给予等量生理盐水雾化。TGP 各剂量组在每次雾化前1 h 给予相应剂量的TGP 混悬液灌胃，TGP+ML385 组在每次雾化前1 h 给予30 mg/kg 的ML385 和920 mg/kg 的TGP 灌胃，Control 组和OVA 组给予等量生理盐水；各组均连续给药8 周，最后一次激发24 h 后进行取材和指标检测。

药物剂量的换算：给药剂量按成人平均体质量70 kg 体表面积换算，小鼠体质量按20 g 计，对应给药剂量为成人的9.1 倍；TGP 成人每日给药剂量为3.6 g，则小鼠每日给药剂量为460 mg/kg，因此设置低、高剂量药物剂量为460、920 mg/kg。

1.2.2 小鼠一般状态观察 观察致敏和激发前后各组小鼠的行为学变化，是否有气促、呼吸困难、打喷嚏、烦躁不安、喘息等典型的哮喘症状。

1.2.3 小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎症相关因子的测定 处死小鼠，75%乙醇浸泡2 min 后，行气管插管，结扎右肺，用1 ml预冷的PBS缓慢冲洗小鼠左肺3次，合并3次灌洗液，纱布过滤去除黏液后离心（4 ℃、2 000 r/min离心10 min），取上清。按照ELISA 试剂盒说明书检测各组小鼠BALF中TGF-β1、CysLT1、CysLTR1水平。

1.2.4 小鼠肺组织氧化应激指标的测定 将小鼠左侧肺组织按照1∶9 的比例加入生理盐水研磨，2 500 r/min 离心10 min 后，取匀浆上清液，按照试剂盒说明书检测肺匀浆中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.2.5 小鼠肺组织病理学变化 取小鼠右肺上叶组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行HE 和AB-PAS 染色，观察气道周围炎症细胞的浸润情况及杯状细胞分泌黏液情况；并对各组肺组织进行病理学分级评分；每只小鼠肺切片任取5 个独立区域进行评分，取平均值。评分标准如表1。

表1 肺组织HE和AB-PAS染色评分标准Tab.1 Lung tissue HE and AB-PAS staining scoring standards

1.2.6 RT-qPCR 检 测 肺 组 织TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表达 取小鼠右肺中叶组织，使用TRIzol 从各组织中提取总RNA，NanaDrop 分光光度计检测总RNA 的浓度和纯度；然后按照试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA，进行PCR 扩增。反应体系（25 µl）：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12 µl，正反向 引 物 各0.5 µl，cDNA（200 ng/µl） 1 µl，ddH2O 11 µl。反应条件：94 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，75 ℃延伸20 s，进行40 个循环。以GAPDH 作为对照，采用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表2。

表2 RT-qPCR引物序列Tab.2 RT-qPCR primer sequences

1.2.7 Western blot检测肺组织TGF-β1/Nrf-2/HO-1通路相关蛋白表达 取小鼠右肺下叶组织，使用含有1%蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液提取细胞总蛋白（用于TGF-β1、HO-1 检测），并采用细胞核蛋白提取试剂盒提取细胞核中的蛋白质（用于Nrf-2检测），然后使用BCA 检测试剂盒进行定量。将样品在98 ℃下加热5 min 变性，取等量蛋白质样品（30 µg/孔）加至10%SDS-PAGE 凝胶上行电泳分离，然后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应一抗（TGF-β1、Nrf-2、HO-1，1∶1 000；GAPDH、Lamin B1，1∶2 000）于4 ℃下孵育过夜，次日，将膜与HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL 显色。以GAPDH、Lamin B1 为内参，通过与内参的灰度比，得出各目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS22.0、GraphPad Prism 8.0 和Image-Pro Plus 6.0 软件进行分析，结果以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间有差异进一步采用SNK-q检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般状态 致敏阶段：各组小鼠表现均正常，各组间无差异。激发阶段：OVA 组小鼠出现典型的哮喘症状，如打喷嚏、烦躁不安、喘息等，而TGP-L 组和TGP-H 组小鼠的哮喘症状较OVA组明显减轻，且TGP-H 组小鼠哮喘症状的改善程度优于TGP-L 组；TGP+ML385 组小鼠的哮喘症状较TGP-H组加重，Control组小鼠表现正常。

2.2 各组小鼠BALF 中TGF-β1、CysLT1、CysLTR1水平 与Control 组相比，OVA 组小鼠BALF 中TGFβ1、CysLT1、CysLTR1 水平显著升高（P＜0.05）；与OVA 组相比，TGP-L 组和TGP-H 组小鼠BALF 中上述指标水平显著降低（P＜0.05），与TGP-H 组相比，TGP-L 组和TGP+ML385 组上述指标水平显著升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠BALF中炎症相关因子水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of inflammatory-related factors in BALF of mice in each group （±s，n=10）

表3 各组小鼠BALF中炎症相关因子水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of inflammatory-related factors in BALF of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

CysLTR1/（ng·ml-1）11.36±2.15 34.74±4.011）23.53±3.291）2）3）17.58±2.301）2）29.86±3.471）2）3）Groups TGF-β1/（pg·ml-1）Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 171.29±24.04 336.50±37.591）292.31±31.251）2）3）247.76±30.451）2）328.14±35.131）3）CysLT1/（ng·ml-1）16.53±2.86 45.61±4.471）33.42±5.181）2）3）22.70±3.521）2）40.39±4.201）3）

2.3 各组小鼠肺匀浆中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性 与Control 组相比，OVA 组小鼠肺匀浆中TAOC、SOD、GSH-Px、CAT 活性显著降低（P＜0.05）；与OVA 组相比，TGP-L 组和TGP-H 组小鼠肺匀浆中上述指标的活性均显著升高（P＜0.05）；与TGP-H 组相比，TGP-L 组和TGP+ML385 组小鼠肺匀浆中上述指标的活性显著降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠肺匀浆中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性（±s，n=10，U/mg prot）Tab.4 Activities of T-AOC， SOD， GSH-Px and CAT in lung homogenate of mice in each group （±s，n=10，U/mg prot）

表4 各组小鼠肺匀浆中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性（±s，n=10，U/mg prot）Tab.4 Activities of T-AOC， SOD， GSH-Px and CAT in lung homogenate of mice in each group （±s，n=10，U/mg prot）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

CAT 6.53±0.73 2.27±0.381）3.30±0.511）2）3）5.27±0.601）2）3.41±0.421）2）3）Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 T-AOC 2.29±0.25 1.10±0.191）1.60±0.211）2）3）2.38±0.272）1.73±0.221）2）3）SOD 114.26±13.71 48.31±7.421）69.52±8.271）2）3）120.67±14.122）75.44±10.651）2）3）GSH-Px 41.30±5.42 15.74±3.051）25.49±3.201）2）3）39.08±4.242）27.26±3.181）2）3）

2.4 各组小鼠肺组织病理学变化 HE 和AB-PAS染色结果显示，Control 组支气管和肺泡结构清晰，肺泡壁无增厚，支气管周围无明显炎症细胞浸润，未见杯状细胞增生；与Control 组相比，OVA 组小鼠肺组织支气管周围可见大量炎症细胞浸润，杯状细胞增生明显，黏液分泌增加，肺组织炎症和黏液分泌评分显著升高（P＜0.05）；与OVA 组相比，TGP-L组和TGP-H 组小鼠肺组织气道炎症明显减轻，黏液分泌减少，炎症和黏液分泌评分显著降低（P＜0.05）；与TGP-H 组相比，TGP-L 组和TGP+ML385 组小鼠肺组织气道炎症和黏液分泌评分均显著升高（P＜0.05）。见图1、表5。

表5 各组小鼠肺组织病理评分（±s，n=10）Tab.5 Histopathological scores of lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

表5 各组小鼠肺组织病理评分（±s，n=10）Tab.5 Histopathological scores of lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 Inflammation score（HE）0 Mucus secretion score（AB-PAS）0 2.34±0.281）1.92±0.261）2）3）1.21±0.171）2）1.86±0.251）2）3）3.26±0.351）2.45±0.281）2）3）1.51±0.171）2）2.37±0.261）2）3）

2.5 各组小鼠肺组织TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表达 与Control 组相比，OVA 组小鼠肺组织TGF-β1、MMP-9 mRNA 表 达 显 著 升 高，TIMP-1 mRNA 表达显著降低（P＜0.05）；与OVA 组相比，TGP-L 组和TGP-H 组小鼠肺组织TGF-β1、MMP-9 mRNA 表达显著降低，TIMP-1 mRNA 表达显著升高（P＜0.05）；与TGP-H 组 相 比，TGP-L 组 和TGP+ML385组小鼠肺组织TGF-β1、MMP-9 mRNA 表达显著升高，TIMP-1 mRNA 表达显著降低（P＜0.05）。见表6。

表6 各 组 小 鼠 肺 组 织TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA表达（±s，n=10）Tab.6 mRNA expressions of TGF-β1， MMP-9 and TIMP-1 in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

表6 各 组 小 鼠 肺 组 织TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 的mRNA表达（±s，n=10）Tab.6 mRNA expressions of TGF-β1， MMP-9 and TIMP-1 in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

TIMP-1 mRNA 1.00±0.00 0.37±0.051）0.50±0.061）2）3）0.74±0.101）2）0.54±0.071）2）3）Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 TGF-β1 mRNA 1.00±0.00 2.74±0.301）2.16±0.251）2）3）1.43±0.181）2）2.07±0.241）3）MMP-9 mRNA 1.00±0.00 3.85±0.471）2.72±0.321）2）3）1.81±0.251）2）2.66±0.331）2）3）

2.6 各组小鼠肺组织TGF-β1/Nrf-2/HO-1通路相关蛋白表达 与Control 组相比，OVA 组小鼠肺组织TGF-β1 蛋白表达显著升高（P＜0.05），Nrf-2 和HO-1蛋白表达有所增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与OVA 组相比，TGP-L 组和TGP-H 组小鼠肺组织TGF-β1蛋白表达显著降低，Nrf-2、HO-1蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与TGP-H 组相比，TGP-L 组和TGP+ML385 组小鼠肺组织Nrf-2、HO-1 蛋白表达显著降低（P＜0.05），TGF-β1 蛋白表达显著升高（P＜0.05）。见图2、表7。

图2 各组小鼠肺组织TGF-β1/Nrf-2/HO-1 通路相关蛋白表达Fig.2 Expressions of TGF-β1/Nrf-2/HO-1 pathway-related proteins in lung tissues of mice in each group

表7 各组小鼠肺组织TGF-β1、Nrf-2、HO-1 蛋白的表达（±s，n=10）Tab.7 Expressions of TGF-β1， Nrf-2 and HO-1 proteins in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

表7 各组小鼠肺组织TGF-β1、Nrf-2、HO-1 蛋白的表达（±s，n=10）Tab.7 Expressions of TGF-β1， Nrf-2 and HO-1 proteins in lung tissues of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with OVA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-H group， 3）P＜0.05.

HO-1/GAPDH 0.21±0.04 0.23±0.04 0.55±0.071）2）3）0.80±0.091）2）0.53±0.061）2）3）Groups Control OVA TGP-L TGP-H TGP+ML385 TGF-β1/GAPDH 0.13±0.02 0.64±0.071）0.41±0.051）2）3）0.29±0.041）2）0.43±0.061）2）3）Nrf-2/Lamin B1 0.15±0.03 0.20±0.04 0.37±0.051）2）3）0.48±0.071）2）0.34±0.051）2）3）

3 讨论

气道重塑是哮喘的主要病理特征之一，目前的临床药物（包括长效β2-激动剂、支气管扩张剂和吸入性皮质类固醇）对气道重塑影响不大［17］。因此，探索对气道重塑有效的药物对哮喘的临床治疗具有重要意义。本研究表明，TGP 通过影响氧化应激减弱OVA 致敏小鼠的气道重塑，这可能为治疗哮喘提供了有力证据。

气道重塑是指气道结构改变，包括上皮下纤维化、ASMCs 和杯状细胞增生及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过多，这些是肺功能下降的主要原因［18］。气道重塑包含多种病理因素，包括过敏原、生长因子、ROS 和促炎因子［19］。如CysLT1 通过与其受体CysLTR1 结合在哮喘中发挥促炎作用［20］；且CysLT1 和TGF-β1 可通过促进ASMCs 的增殖和迁移促进气道重塑，加速气道壁增厚［21-22］。有研究表明，ASMCs 增生或TGF-β1 的调节是消除气道重塑的潜在治疗靶点［2-3］。本研究发现TGP 减少了OVA 小鼠的肺泡炎症浸润和气道重塑，同时抑制了TGF-β1、CysLT1 和CysLTR1。然而，其他CysLTs 也在哮喘的炎症反应和气道重塑中发挥关键作用，TGP 介导气道重塑和炎症反应的改善是否与其他CysLTs 有关仍需进一步研究［23］。此外，氧化应激引起的气道重塑也引起了研究人员的广泛关注。氧化应激可通过激活NF-κB 的免疫反应性促进肺炎症因子表达［24］；且氧化应激介导TGF-β1 的激活导致AMSCs 的高反应性和上皮损伤［25-26］。ECM 也是氧化应激诱发的气道重塑过程中的标志之一，氧化应激激活介导了基质金属蛋白酶的产生，也促进了肺纤维化、ECM 和组织结构改变，导致气道重塑［27］。本研究结果显示，TGP 降低了哮喘小鼠肺中TGF-β1和MMP-9 表达，并提高了TIMP-1 及抗氧化应激相关因子表达。表明TGP 提高了抗氧化防御，并降低了下游MMP-9表达，进一步证实TGP 介导了哮喘中氧化应激过程的抑制。

Nrf-2 参与氧化应激诱导的肺损伤过程，一旦受到氧化应激的刺激，Nrf-2 就会进入细胞核并激活HO-1 表达，从而缓解氧化应激［28］。Nrf-2/HO-1 通路是对抗氧化损伤的主要防御机制，激活的Nrf-2位于细胞核中，可使HO-1、SOD、CAT 和GSH-Px 激活［29］。在哮喘中，Nrf-2/HO-1 通路激活可降低MMP-9 表达［30］。基于Nrf-2激活对氧化应激的抑制作用，课题组假设Nrf-2 和HO-1 的表达水平可能会因OVA 的反应而降低，但结果表明二者并未发生显著变化，相反，在OVA 的刺激下，Nrf-2、HO-1 表达有所增加。课题组认为模型小鼠核Nrf-2和HO-1的增加可能是肺在巨大氧化压力和炎症条件下的代偿作用，是小鼠的适应性保护机制，与PAN 等［31］的研究结果一致，即在OVA 的刺激下，Nrf-2 被释放并在肺组织的细胞核中适度积累。通过给予TGP 干预后，Nrf-2的核表达和随后HO-1 的表达显著增加；说明TGP 可扩大Nrf-2的核表达。而在哮喘小鼠中，当使用Nrf2抑制剂ML385 阻断Nrf-2/HO-1 通路的激活后，TGP对哮喘小鼠肺组织氧化应激和气道重塑的抑制被明显减弱，这些数据表明TGP 可降低TGF-β1 表达，并可通过激活Nrf-2/HO-1信号转导进一步激活抗氧化防御机制。

综上所述，TGP 可调节氧化应激和炎症诱发的支气管哮喘小鼠的气道重塑，其作用机制可能与降低TGF-β1表达，激活Nrf-2/HO-1通路有关。本研究仅从氧化应激和炎症反应的角度初步探讨了TGP对支气管哮喘小鼠气道重塑的保护机制，在未来的研究中，课题组将采用体外细胞实验深入分析其作用机制；此外，由于气道重塑与免疫细胞释放的促炎细胞因子有关，以及TGP 具有强大的免疫调节作用，其发挥作用的具体机制是否与机体免疫有关仍需进一步研究。