刘 欣,黄银珠,金成日

龋病是在以细菌为主的多种因素影响下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。药物治疗是临床上常用的预防龋病和治疗早期釉质龋的方法,通过使用某些药物(氟、矿化液、中药及木糖醇等)使牙釉质再矿化,阻止龋病进展。各种药物治疗中,以局部涂氟治疗最为常见。临床上有多种氟化物制剂可供使用,如氟化物溶液、氟凝胶、含氟牙膏等[1-2]。2009年,DMG公司开发了一种新型渗透材料即Icon渗透树脂应用于治疗早期龋。它是一种低黏度树脂[3],主要由双酚A甲基丙烯酸缩水甘油酯(bisphenol a methacrylate glycidol,Bis-GMA)、二甲基丙烯酸三甘醇酯(triethylene glycol dimethyl acrylate,TEGDMA)、光引发剂和溶剂乙醇组成。研究认为Icon渗透树脂的粘接性能、抗磨耗性能、硬度及粗糙度、美观性能等方面均具有优势,因此Icon渗透树脂的治疗效果受到肯定[3-10]。

本实验对离体牙采用酸凝胶法形成人工龋,运用原子吸收分光光度计检测经渗透树脂处理后牙釉质在酸性环境下溶出的Ca2+含量,以氟保护漆和氟化钠溶液作对照,评价渗透树脂对人牙釉质抗酸性的影响。采用扫描电镜观察釉质表面及纵剖面的超微结构,评价渗透树脂封闭釉质脱矿区的情况,从而深入探讨渗透树脂的抗酸性能及防龋效果,为选择安全有效、简单易行的早期釉质龋治疗方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

收集北京航天总医院口腔门诊2021—2022年因正畸拔除的上下前磨牙110颗,患者10～25岁。10倍体视显微镜下观察并选择牙冠完整、无龋坏、无缺损、无变色、无裂纹的牙齿。排除标准:有充填物或龋坏的牙齿、釉质发育不全、氟斑牙、四环素牙、死髓牙。去除牙周膜,用超声洁治器去除牙齿表面菌斑和牙石,充分清洁后放于含有1%麝香草酚液的生理盐水中冷藏(4 ℃)保存,6个月内使用。

1.2 主要仪器与试剂

体视显微镜(Alpha,英国);Isomet 4000硬组织切片机(Buehler,美国);S-4800扫描电镜(HITACHI,日本);Ⅱ6300原子分光光度计(岛津,日本);37 ℃生化培养箱(上海福玛实验设备有限公司,中国);pH离子计(ORION868,美国);3.0 mm打孔器(Harris Micro-punch,美国);HZS-H水浴振荡器(东方化玻科技有限公司,中国);B3510E-DTH超声波洗涤器(Branson,美国);YM-ZA金相试验预磨机(上海金相机械设备有限公司,中国);BSA124S电子天平(赛多利,德国);多功能图像分析仪、BH-2显微镜(奥林巴斯,日本)。

抗酸指甲油(大宝公司,中国);Icon渗透树脂(DMG公司,德国);15%盐酸胶状酸蚀剂(DMG公司,德国);0.5%氟保护漆(莱可丽专业产品公司,美国)。制备人工唾液(1 000 mL蒸馏水中加入KH2PO40.330 g,Na2HPO40.340 g,KCl 1.270 g,NH4Cl 0.160 g,CaCl2·2H2O 0.170 g,NaCl 0.580 g,NaSCN 0.160 g,尿素 0.200 g,葡萄糖 0.030 g,维生素C 0.002 g,黏蛋白2.700 g,以上各成分混合溶解后,pH调至6.8,高压消毒灭菌后备用);制备人工龋液(0.1 mol/L 乳酸100 mL加入高黏度羟乙基纤维素3 g,调匀,用NaOH调节pH=4.5,37 ℃恒温下静置,待气泡完全消失后使用);0.02%氟化钠溶液、酸性溶液(50 mmol/L HAC,2.2 mmol/L Na2HPO4,以去离子水配成1 L,用NaOH调节pH=5.0)、0.5 mol/L硝酸溶液、20 g/L氧化镧溶液(称取纯度>99.99%的氧化镧23.45 g,先用少量水湿润再加75 mL盐酸于1 000 mL容量瓶中,加去离子水稀释至刻度)。

1.3 方法

1.3.1 人工釉质龋的建立

用打孔器在胶带上打出直径为3 mm的圆孔,粘接于经过处理的离体牙颊侧釉质表面处,揭去胶带,形成直径为3 mm的圆形开窗区,剩余牙体用抗酸指甲油覆盖两次。在距牙根尖1 mm处打孔,穿入铁丝,将离体牙悬吊在含有人工龋液的烧杯内(一般1个样本需要20～25 mL的人工龋液),保证离体牙牙冠完全浸入人工龋液中,牙根部位暴露在空气中,样本连续浸泡4 d,每天更换一次人工龋液,保证37 ℃恒温。4 d后取出标本,清水冲洗待用。

1.3.2 实验分组

随机取样本10个,将牙根部包埋于自凝树脂材料中,用硬组织切片机垂直开窗区表面。沿牙齿纵剖面由牙冠向根方进行连续切片,在玻璃磨板上磨至250 μm厚,在40倍光镜和扫描电镜下观察脱矿情况。每个样本选择3个切片,每个切片随机选择3个位置进行测量,取其平均值作为该样本的平均脱矿深度。余下100颗样本随机分成5组,每组20颗。渗透树脂组为A组,氟保护漆组为B组,氟化钠组为C组,去离子水组为D组,涂布指甲油组为E组。

渗透树脂组(A组):开窗区涂布渗透树脂,按照产品说明书操作,首先在开窗区采用15%HCl酸蚀120 s,冲洗30 s,99%乙醇干燥脱水30 s,用小毛刷涂布Icon渗透树脂3 min,轻微吹干10 s,光照40 s,再涂布渗透树脂1 min,同样光照40 s。

氟保护漆组(B组):开窗区吹干,涂布氟保护漆(含有5%的NaF,其中氟离子浓度为2.26%,以松香作为基质)2次,自然干燥。

氟化钠组(C组):样本浸入0.02%氟化钠溶液中24 h,然后取出,自然干燥。

阳性对照组(D组):开窗区涂布去离子水,自然干燥。

阴性对照组(E组):开窗区涂布抗酸指甲油2次,自然干燥。

5组样本均保存在人工唾液中24 h,37 ℃恒温。

1.4 观察指标

1.4.1 Ca2+溶出量的测定

将样本分别悬吊放入10 mL带盖的一次性塑料离心管内,每个离心管中加入酸性溶液5 mL(保证样本牙冠全部浸入),盖紧,放置于水浴恒温振荡器内。37 ℃恒温回旋振荡24 h后取出样本,离心管内的溶液留作进行Ca2+溶出量的测量。Ca2+溶出量采用原子分光光度计测量。

1.4.2 扫描电镜观察

使用硬组织切片机垂直开窗区表面,沿牙齿长轴方向切开,一部分做连续切片,玻璃磨板磨至250 μm厚,超声洗涤后备用,开窗区的纵剖面进行扫描显微镜观察。另一部分超声洗涤备用,开窗区的表面进行扫描电镜观察。

1.5 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件包,5组样本的Ca2+溶出量采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)进行统计学检验,Tukey HSD法进行各组间比较,分析3种材料对釉质表面抗酸性能影响的差异。

2 结 果

2.1 人工釉质龋的建立

脱矿后样本的切片在40倍体视显微镜下观察,釉质层形成以表层下脱矿为主要特征的病理改变,可见较为完整的釉质表层及下方的病损体部。并且病损范围均在釉质浅层,未达到釉牙本质界(图1)。测量样本的脱矿深度为(0.551±0.658)mm(n=10)。

A:正常牙釉质;B:脱矿牙釉质;黑箭头:脱矿的釉质表层;白箭头:釉质脱矿范围

在扫描电子显微镜下观察,正常釉质表面光滑平整(图2A)。人工龋釉质表面可见孔隙增大,呈现带有很多凹坑状的、不规则的外观。釉柱晶体溶解,结构破坏(图2B)。人工龋剖面见釉质表层较完整,表层下方釉柱间隙增大,可见与釉质生长线一致的短裂隙状改变,向内延伸。表层下方脱矿区脱矿深度较一致,病损范围局限在釉质层(图3)。

A:正常釉质;B:釉质龋表面

a:牙釉质;b:牙釉质脱矿区;白箭头:脱矿的釉质表层

2.2 Ca2+溶出量的测定结果

阴性对照组、渗透树脂组、氟保护漆组、氟化钠组、阳性对照组Ca2+溶出量分别为(0.109±0.535)、(6.432±1.867)、(31.208±7.784)、(41.176±3.512)、(77.616±10.789)μg/mL。

经单因素方差分析(one-way ANOVA),渗透树脂组、氟保护漆组及氟化钠组分别与阳性对照组、阴性对照组之间差异有统计学意义(P<0.05),其中阳性对照组的Ca2+溶出量明显高于渗透树脂组、氟保护漆组及氟化钠组(P<0.01),氟保护漆组及氟化钠组的 Ca2+溶出量明显高于阴性对照组(P<0.01),渗透树脂组的Ca2+溶出量略高于阴性对照组(P<0.05)。经one-way ANOVA中的Tukey HSD检验,3个实验组之间两两比较,差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

表1 实验组和对照组牙釉质Ca2+溶出量(24 h)的比较

2.3 实验后的样本SEM观察结果

渗透树脂组(A组)可见釉质表面有完整、相对平滑的材料覆盖,呈条纹状,在高倍镜下未见到明显的孔隙结构(图4A、B)。观察开窗区纵剖面,可见釉质表层覆盖一薄层树脂材料,较致密。渗透树脂能较好地占据表层下釉质由于脱矿所产生的孔隙,且材料相对致密,呈密集的网筛状。材料沿着牙釉质的釉柱间隙渗透,病损体部的大部分被材料完全渗入,仅有少部分脱矿的釉质区域未见渗入的材料。龋损部位从底部到上方形成了一个不规则的树脂带(图4C、D)。氟保护漆组(B组)可见牙釉质表面完整,覆盖一层漆膜,似碎玻璃状晶体结构,局部可见凹陷痕迹、裂纹、孔隙,但裂纹和孔隙较小(图4E、F)。观察开窗区纵剖面,可见釉质表层被一薄层材料覆盖,材料呈丝网状,不致密,釉质内可见到大面积的白色团块状沉积物,形态不规则,但仍有部分脱矿区域未见到白色沉积物(图4G、H)。氟化钠组(C组)釉质表面孔隙清晰,孔隙直径明显大于氟保护漆组,釉质表面有成片的小块状的白色沉积物覆盖,数量较少,釉质表面结构尚完整(图4I、J)。开窗区纵剖面见釉质表层覆盖物不完整,釉质内可见少量的不规则白色沉积物充填釉质孔隙,正常釉柱结构消失,结构紊乱(图4K、L)。阳性对照组(D组)表现为釉质表面结构的破坏,高倍镜下釉质表面布满了酸蚀脱矿的孔隙(图5)。

红箭头示釉质表面暴露的牙体组织;白箭头示白色沉积物斑外观。Icon渗透树脂渗入后的折光率接近正常牙釉质的折光率,使美观得以改善[15]。Enan等[13]提出正畸患者在戴上托槽后很可能会出现白垩病变,可以在矫正前或矫正后使用渗透树脂,通过再矿化脱矿的牙釉质来达到更满意的矫正效果。国内学者也有类似报道,通过比较渗透树脂与氟保护漆治疗正畸后产生的龋白斑,发现渗透树脂能明显改善白垩斑的美观问题[16-17]。

图5 阳性对照组釉质表面SEM图像

3 讨 论

本实验采用构建人工龋模型来模拟自然状态下形成的龋。酸凝胶法模拟口腔的酸性环境,较其他方法操作简单、重复性强、容易控制,能获得与自然釉质龋损相似的病变结构[11],单纯研究龋病的进展和矿物盐离子的变化常采用此方法。本实验采用酸凝胶法连续脱矿4 d制备人工釉质龋,样本经过酸凝胶脱矿液处理后,肉眼可见呈均匀的白垩色改变的脱矿区。光镜及扫描电镜观察,脱矿的牙釉质表层完整,且表层下方脱矿区脱矿深度较一致,脱矿深度为(0.551±0.658)mm,病损局限在牙釉质层。

早期龋的发生是牙釉质脱矿与再矿化交替进行的动态过程,酸对釉质的损害首先发生在釉柱鞘,然后是釉柱芯和釉柱间质,釉质结构破坏,呈多孔性,从表及里有许多微小通道,这些微小通道相互连通构成网络系统,使脱矿过程中溶解的矿物质如钙、磷离子等向外扩散,通过检测从牙齿中脱出的Ca2+浓度,可以反映釉质脱矿的程度。原子吸收分光光度计是一种检测溶液中微量原子浓度的常用标准仪器,它可以准确地定量检测牙釉质中脱出的Ca2+浓度。本实验通过测量釉质中Ca2+溶出量来衡量渗透树脂材料提高釉质抗酸性能的程度。实验结果显示渗透树脂组Ca2+溶出量为(6.432±1.867)μg/mL,明显低于阳性对照组(77.616±10.789)μg/mL、氟保护漆组(31.208±7.784)μg/mL及氟化钠组(41.176±3.512)μg/mL。说明渗透树脂应用后,减少了釉质表面在酸性环境下的Ca2+溶出量,可以提高釉质表面的抗酸能力,且优于氟保护漆及氟化钠。渗透树脂组检出的Ca2+溶出量高于阴性对照组(0.109±0.535)μg/mL,说明渗透树脂组仍有一定的Ca2+溶出,即渗透树脂材料不能完全抑制釉质的进一步脱矿,这与Paris等[12]报道的研究结果相同。Enan等[13]用可乐和红牛制造酸性环境,经实验得出在酸性环境中渗透树脂对脱矿的牙釉质有保护作用。梁向阳等[14]同样在碳酸饮料中做实验发现渗透树脂能够有效地阻断碳酸饮料所致牙釉质脱矿的发展。本实验中,样本一直处于酸性环境中,渗透树脂虽然不能完全抑制釉质脱矿,但是与氟保护漆、氟化钠相比,渗透树脂在提高釉质表面的抗酸性能方面,已经具有明显的优势。渗透树脂提高釉质表面的抗酸性能效果还需要长期观察和研究。

Torres等[10]进行了渗透树脂的颜色稳定性实验,证明了渗透树脂可以较好地覆盖脱矿釉质区的白垩色,使其接近正常釉质色,恢复美观。其中釉质的折光率取决于晶体的空间大小,在早期龋时随着晶体开始溶解,产生了脱水,水又被替换成空气,折光率从大变小, 因此随着对光的散射不同出现了白渗透树脂是一种采用渗透原理治疗早期龋的新型材料。渗透树脂治疗早期龋的原理是封闭釉质由于脱矿造成的孔隙,从而阻止进一步脱矿[18]。Meyer-Lueckel等[3]使用横断显微放射照相术(transverse microradiography,TMR)和激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)检测发现,Icon渗透树脂在自然龋釉质层内的渗透深度大约为171 μm,经过光照固化,渗透树脂机械性地固化在部分溶解的羟基磷灰石上,形成树脂-多孔羟基磷灰石复合体,填满釉柱间隙,堵塞釉质表面孔隙,封闭了龋损进展通道,使致龋酸不能渗入釉质深层,阻止病变发展。Perdigão[19]发现白垩区域釉质表面晶体被渗透树脂聚合物包裹,而实验得出树脂聚合物与釉质的结合相比于釉质更能抵抗酸的侵蚀,从而阻止进一步脱矿。梁向阳等[14]通过激光共聚焦扫描显微镜下观察,发现经渗透树脂处理的离体牙釉质表面较光滑平坦,无明显凹陷,荧光染料沉积较少,仅在釉质最表面看到较微弱的荧光图像。本实验SEM观察结果显示,渗透树脂组可见釉质表面完整、相对平滑,条纹状,未见到明显的孔隙结构。纵剖面观察可见釉质表层覆盖一薄层树脂材料,较致密均匀。少部分脱矿的釉质区域未见渗入的材料。釉质表层一薄层未渗入的树脂材料构成了一个树脂膜,虽然能较好地封闭釉质表面孔隙,提高了釉质的抗酸性能,但也说明了渗透树脂的渗透性能有限。渗透树脂具有聚合收缩性能[20],树脂材料在聚合时会伴随一定的体积收缩,材料内部会产生内聚力,从而引发材料的微裂纹、微隙[21],酸性物质易通过这些微裂纹或者微隙进入釉质,使釉质继续脱矿。虽然本实验SEM观察显示釉质表面未见到明显裂纹及孔隙,但渗透树脂提高釉质抗酸性能的长期效果还有待于研究。

本实验的结果提示渗透树脂能提高釉质表面的抗酸性能,阻止龋进展,明显优于氟保护漆及氟化钠,在早期釉质平滑面龋防治方面具有优势。由于此材料临床应用时间较短,长期的临床效果还有待进一步研究;渗透树脂具有较强的渗透性,材料能在釉质表层形成一薄层树脂膜,并能较好地渗入到釉质孔隙中,和氟保护漆在釉质表面形成的漆膜相比,此层结构更加均匀致密、平滑,能较好地封闭釉质的脱矿孔隙,阻止酸性物质对釉质的进一步侵蚀。本实验采用体外形成的人工釉质龋,和临床上致龋环境存在一定差异,真实的口腔环境有可能存在影响渗透树脂治疗效果的因素[22],还需研究其临床的使用效果。此材料在口腔临床领域有着广阔的应用前景。