马天怡 毛 敏 吴秋月 赵 益 朴英实 金桂花 任香善

（延边大学医学院病理学教研室肿瘤研究中心，延吉 133002）

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，通常发生在儿童时期，临床表现包括皮肤干燥、发作性急性湿疹、渗出性瘙痒性皮损［1］。AD 具有广泛的症状和体征，会限制日常活动能力，造成较重的心理负担［2］。AD 的发病机制较为复杂，且尚未明确，不少学者认为AD 的发病受遗传和环境因素的双重影响，与遗传疾病、表皮屏障缺陷、免疫反应改变以及皮肤微生物平衡破坏关系密切，其中以Th1/Th2 失衡最为关键［3-5］。AD 尚无有效的治愈方式，相关症状只能被缓解，避免疾病反复发作，其主要治疗药物为糖皮质激素、抗组胺药物、抗生素、免疫抑制剂等，但这些药物均伴随一些不良反应，如肝功能损伤、胃肠道不适、白细胞和血小板减少等［6-7］。为了更好地改善AD 患者的疾病状况，越来越多的学者开始研究中草药有效成分对AD 的治疗效果，以期找到治疗效果好、副作用小、经济实惠的AD治疗药物［8-11］。

蒲公英（taraxasterol，Tar）作为一种传统中草药，有清热解毒、利尿通淋、清肝明目的作用，临床上常用于痈、肿等的治疗。蒲公英甾醇是蒲公英中具有抗炎作用的重要活性成分之一［12-14］。目前，国内外学者均有证实蒲公英甾醇通过降低炎症因子TNF-α、IL-4、IL-6 等的水平治疗结肠炎、肝损伤、类风湿关节炎、肾损伤等相关疾病［15-20］，但尚未见蒲公英甾醇治疗AD 的相关报道。本实验拟初步探讨蒲公英有效成分蒲公英甾醇对2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）诱导的AD 小鼠模型的治疗作用及可能的分子机制，为蒲公英甾醇的应用和开发提供实验数据，以期拓宽AD 的治疗途径，寻求治疗效果更好、副作用更少、更经济便利的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实 验 动 物 46 只6～8 周 龄SPF 级 雄 性BALB/c 小鼠，体质量（20±2） g，购自延边大学实验动物中心，饲养于延边大学医学院动物房。动物房温度为（24±1） ℃，湿度为（45±10）%，由国家标准固体混合饲料喂养，自由摄食和饮水。

1.1.2 药物与试剂 DNCB（Sigma 公司，D1529）与基质（丙酮∶橄榄油=1∶3）配成的0.5%、0.25%的DNCB 溶液常温避光保存；泼尼松龙（SP8730）、羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl，CMC，C8621）（索莱宝生物科技有限公司）；蒲公英甾醇（纯度99.9%，成都瑞芬思生物科技有限公司，P-002）；氯化钠注射液（南华干牧，兽药字270071460）；小鼠TNF-α、IL-4、IL-6 ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，ml002095、ml1002049、ml1002093）；HE 染色剂（北京中杉金桥公司，ZLI-9610）；重组Anti-CD4 抗体（Abcam，ab183685）；兔二步法试剂盒（PV-9000）、PBS 缓冲液（ZLI-9063）、免疫组化抗原修复缓冲液（ZLI-9067）、DAB 显色试剂盒（ZLI-9018）均为北京中杉金桥公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 适应性喂养7 d 后，将46 只小鼠随机分为空白对照组、药物毒性组（该组不做AD 建模，只给予蒲公英甾醇检验药物毒性）、模型对照组、阳性对照组、低浓度蒲公英甾醇组、高浓度蒲公英甾醇组。前两组每组3 只，后四组每组10只。

采用JIN 等［21］和张茜等［22］DNCB 半抗原反复刺激的方法建立小鼠AD 模型。具体建模方法如下：于实验前1 d（Day 0）用电推剪进行小鼠腹部剃毛，露 出 约2 cm×2 cm 大 小 的 皮 肤。实 验 第1 天 将0.5%DNCB涂于小鼠左耳（20 µl）及腹部（100 µl）剃毛处皮肤进行初次致敏，第5、7、9、11、13 天改用0.25%DNCB 涂于小鼠左耳（20 µl）及背部（100 µl）剃毛处皮肤进行激发，即隔日刺激1 次，持续10 d（图1）。空白对照组和药物毒性组仅涂DNCB 的溶剂，涂抹时间及涂抹剂量与模型组相同。实验期间小鼠自由进食、饮水，并按照实验动物3R 原则给予人道主义关怀。

图1 小鼠AD建模及各组处理方法Fig.1 Mice AD modeling and treatments in each group

1.2.2 给药方法 小鼠分为药物毒性组、空白对照组、模型组、阳性对照组、蒲公英甾醇组。DNCB涂抹建模后Day15开始以口服灌胃方式进行14 d的治疗。阳性对照组每天给予泼尼松龙10 mg/kg［23］；蒲公英甾醇浓度参考文献［24-26］，分别采用5 mg/kg、10 mg/kg 两个浓度，药物毒性组、空白对照组、模型组每天给予等体积CMC（图1）。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 建模指标 AD 小鼠模型造模成功后皮肤开始出现明显的红斑、水肿和结痂等表现，左耳厚度明显增厚，搔抓次数明显增加，分值越高表明模型建立越成功。

1.2.3.2 小鼠皮损程度评分 Day 14 肉眼观察激发部位皮肤，参考临床特应性皮炎积分（SCORAD）指数评价标准对小鼠皮损程度进行评价［27］。评价标准为：重度红斑、水肿、鳞屑、表皮脱落计3 分；中度红斑、水肿、鳞屑、表皮脱落计2 分；轻度红斑、水肿、鳞屑、表皮脱落计1分；正常皮肤计0分。

1.2.3.3 小鼠左耳厚度的记录及变化程度评分Day 0 开始用游标卡尺测量小鼠左耳中部厚度并进行记录，DNCB 激发后于Day 7、Day 14 再次测量、记录，计算小鼠左耳中部厚度差距。根据厚度分级：刺激前后耳朵厚度明显增加计1 分；刺激前后耳朵厚度无明显变化计0分。

1.2.3.4 小鼠搔抓次数的记录及评分 记录Day 0、Day 7、Day 14小鼠的搔抓次数。测定方式为将小鼠单独置于安静环境中，拍摄并统计10 min 内小鼠搔抓耳部及腹部的次数，后肢连续搔抓耳部及腹部视为1次搔抓活动，当后爪落地或被舔舐时代表本次搔抓结束，连续长时间搔抓记为1 次。根据小鼠搔抓次数评分：刺激前后搔抓次数明显增加计1分；刺激前后搔抓次数无明显变化计0分。

1.2.4 治疗指标

1.2.4.1 小鼠皮损程度评分 Day 28 观察表皮剥脱、出血、渗出、红斑、结痂的变化。评分标准同

1.2.3.2。

1.2.4.2 小鼠左耳厚度记录 Day 15 开始给予处理措施后，于Day 21、Day 28再次用游标卡尺测量小鼠左耳中部厚度并进行记录，计算小鼠左耳中部厚度差距，根据厚度分级：小鼠耳朵厚度无明显改变计1分；小鼠耳朵厚度明显降低计0分。

1.2.4.3 小鼠搔抓次数记录 记录Day 21、Day 28的小鼠搔抓次数。根据小鼠搔抓次数评分：小鼠搔抓次数无明显减少计1 分；小鼠搔抓次数明显减少计0分。分值越低表明药物治疗效果越好。

1.2.4.4 称重计算小鼠胸腺指数、脾指数 Day 29将小鼠安乐死，取胸腺、脾脏（用滤纸吸干多余的血液）称重（精确到0.1 mg）并进行数据分析。胸腺指数（mg/g）=胸腺重量（mg）/体重（g）×10；脾脏指数（mg/g）=脾脏重量（mg）/体重（g）×10。

1.2.4.5 ELISA 检测炎症因子 Day 29 按照试剂盒说明将小鼠眼球摘除取血1 ml，室温下自然凝固10～20 min。4 ℃、2 000～3 000 r/min 离心20 min，取血清，储存于-20 ℃。ELISA 检测各组TNF-α、IL-4、IL-6三种炎症因子水平。

1.2.4.6 HE 染色 Day 29 将小鼠安乐死，取小鼠距耳缘约5 mm 处耳部皮损组织和腹部皮损组织用10%甲醛固定48 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切4 µm 厚片，45 ℃烤片烘干，二甲苯脱蜡，苏木精-伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。显微镜下观察表皮间隙有无水肿，表皮有无角化过度或角化不全，棘层及颗粒层厚度，真皮炎症细胞（以嗜酸性粒细胞为主）浸润情况。

1.2.4.7 免疫组化 ①脱蜡和水化：切片置于60 ℃烤箱中烘烤2 h，而后依次浸入二甲苯15 min 2 次，无水乙醇15 min 2 次，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min；②抗原修复：置于EDTA 溶液中，95 ℃加热10 min，室温降温，PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min；③内源性过氧化物酶封闭：加入阻断性内源性过氧化物酶适量反应10 min，PBS 缓冲液冲洗3 次，每次3 min；④抗原抗体结合：免疫组化笔描边后，每张玻片加入100 µl一抗反应，4 ℃过夜，第2 天加入反应增强液，37 ℃反应20 min，随后加入二抗，37 ℃反应20 min；⑤显色：加入新鲜配制的DAB 显色液，室温孵育1 min 左右，自来水冲洗；复染：自来水冲洗，苏木素染色液孵育30 s，分化、冲洗反蓝，随后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察染色结果，并观察CD4+T淋巴细胞浸润情况。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS22.0及Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AD 建模结果 空白对照组评分为0，建模各组评分均＞4 分，建模小鼠皮肤均出现明显的红斑、水肿、结痂、角皮脱落、左耳厚度增加、搔抓次数增多等表现。与空白对照组相比，AD 建模各组评分升高，差异有统计学意义，提示AD 小鼠模型建立成功（P＜0.01，图2A、B、表1）。

表1 小鼠AD情况评分比较（±s）Tab.1 Comparison of AD condition scores in mice （±s）

表1 小鼠AD情况评分比较（±s）Tab.1 Comparison of AD condition scores in mice （±s）

Note：1） P＜0.01 vs blank control group；2）P＜0.01 vs model control group；3） P＜0.01 vs L-Tar group.

Groups Atopic dermatitis in mice Post modeling scoring 0 4.750±0.4331）4.714±0.4511）4.700±0.4581）4.889±0.3141）Post treatment score 0 4.625±0.4841）1.429±0.4951）2）3）3.500±0.5001）2）1.444±0.4971）2）3）Blank Model Positive L-Tar H-Tar

图2 给药后小鼠生理改变Fig.2 Physiological changes of mice after administration

2.2 各组小鼠耳厚、搔抓次数统计 随着DNCB 的刺激，与空白对照组相比，建模各组小鼠耳厚明显增厚（P＜0.01），搔抓次数明显增加（P＜0.01）。给予药物干预后，小鼠AD 情况得到改善。与模型组相比，低、高浓度蒲公英甾醇组小鼠耳厚明显变薄（P＜0.01），搔抓次数减少（P＜0.01），与泼尼松龙阳性对照组表现相符，高浓度蒲公英甾醇组较低浓度蒲公英甾醇组降低程度更加明显（P＜0.01，图3）。

图3 小鼠耳厚、搔抓次数统计Fig.3 Statistics of mouse ear thickness and scratching times

2.3 小鼠治疗评分 给予药物治疗后，小鼠AD 皮损情况明显改善。与模型对照组相比，小鼠皮损情况好转，皮肤结痂，无红斑，无出血，毛发开始正常生长，左耳厚度明显变薄，搔抓次数明显减少（P＜0.01），皮炎情况评分明显降低，且与药物浓度呈正相关（P＜0.01）。见图2A、B、图3、表1。

2.4 各组脏器指数比较 与模型组相比，低、高浓度蒲公英甾醇可明显降低AD 模型小鼠的胸腺指数（P＜0.01，图4A），其效果与泼尼松龙阳性对照组的免疫抑制作用一致；低、高浓度蒲公英甾醇亦可显著降低小鼠脾脏指数（P＜0.01，图4B），推测可能与抑制被过度激活的B淋巴细胞有关。脏器指数的降低与药物浓度呈正相关。

2.5 各组皮损组织病理变化 与模型组相比，蒲公英甾醇治疗组小鼠镜下可见表层增厚水肿、过度角化、炎症细胞浸润、棘层肥厚等情况明显减轻。随着蒲公英甾醇浓度升高，治疗效果明显增强（图5A），且对肝肾无明显毒性（图5B、C）。提示蒲公英甾醇能明显改善小鼠AD的皮肤状况，促进恢复。

图5 给药后小鼠病理改变Fig.5 Pathologic changes of mice after administration

2.6 各组免疫组化结果 给予药物后，CD4+T 细胞浸润情况好转。与模型组相比，阳性对照组、低浓度蒲公英甾醇组、高浓度蒲公英甾醇组、病变周围CD4+T 细胞减少，表明蒲公英甾醇具有治疗效果，可以降低AD 炎症程度（图6），提示蒲公英甾醇可以减轻CD4+T细胞的炎症浸润情况，促进恢复。

2.7 各组血清中炎症水平检测 两种不同浓度给药组血清中炎症因子TNF-α 含量的平均值分别为171.44、166.44，与模型组（243.78）相比明显降低；同时，阳性对照组、低浓度蒲公英甾醇组、高浓度蒲公 英 甾 醇 组 中IL-4（8.72、7.96）、IL-6（23.29、21.98）含量相比模型组（17.50；45.13）显著降低（P＜0.01）且与药物浓度呈正相关（P＜0.01，图7）。提示蒲公英甾醇能够显著降低血清中炎症因子TNF-α、IL-4、IL-6水平。

3 讨论

AD 是一种与遗传和过敏相关的，表现为皮肤干燥、剧烈瘙痒的皮肤病。AD 的发病机制包括免疫系统功能障碍和表皮屏障功能障碍，与遗传、免疫、环境等多重因素相关［1］。该疾病多发生于婴儿期，患病率呈逐年上升趋势［28］。虽然AD 具体的发病机制尚未明确，但Th1/Th2 细胞失衡被认为是AD发生的主要原因之一。在AD 的发病中，炎症细胞浸润显著增加、Th2 相关细胞因子介导B 细胞活化使免疫球蛋白E（IgE）水平显著升高，且Th2 相关细胞因子可在诱导Th2 细胞活化增加的同时抑制Th1细胞。增加的IgE 与肥大细胞和嗜碱性粒细胞相关受体反应是AD 发生的主要机制。IL-4、IL-6 等炎症因子可诱导CD4+向Th2 分化，Th2 分泌IL-4 在B 细胞向IgE 转化中发挥关键作用。Th1 和Th22 分泌的TNF-α是公认的细胞促炎症因子，被认为是AD的诱因。因此调节Th1/Th2平衡可以改善疾病（图8）［29-31］。

图8 蒲公英甾醇改善AD的相关机制Fig.8 Mechanism of dandelion sterol improving AD

当前治疗AD 的药物主要有皮质类固醇和免疫抑制剂，但这些药物均有较为严重的副作用。因此，愈来愈多的学者开始从中草药中探索新的AD治疗药物，以期找到疗效显著、服用方便、副作用小的新型药物［8-11］。蒲公英甾醇是蒲公英的主要活性成分之一，研究表明，该成分对肝损伤、类风湿关节炎、肾损伤等多种疾病模型均有治疗作用，其中最为显著的是抗炎作用［15］。蒲公英甾醇已被证明可通过抑制炎症介质TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8 等的产生抑制溃疡性结肠炎［17］；通过调节κB 抑制剂、IκB 激酶和转化生长因子活化激酶1（transform growth factor β activated kinase 1，TAK1）抑制 核 因子-κB（NF-κB）激活以抑制IL-1β 诱导的小鼠类风湿关节炎［18］；通过调控TLRs/NF-κB 和Bax/Bcl-2 等炎症相关信号转导通路改善肝损伤等炎症［20］。

本研究中，蒲公英甾醇的应用剂量参考文献［24-26］，采用了5 mg/kg 和10 mg/kg 浓度。本研究结果表明，蒲公英甾醇能明显改善AD 小鼠模型的皮肤病理状态，降低皮肤厚度，减少搔抓次数，减少炎症细胞浸润，对AD 具有良好的治疗作用，且对肝、肾无明显药物毒性，副作用少。同时ELISA结果显示，应用蒲公英甾醇的各组小鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6 水平显著降低。提示蒲公英甾醇可能通过调节这3种炎症因子调节Th1/Th2的平衡紊乱，减少IgE转化，从而抑制AD的发展，缓解AD情况。因此蒲公英可能是治疗AD 的具有发展前景的一类中草药。本研究为临床使用蒲公英甾醇治疗AD 提供了部分理论支持，但蒲公英甾醇治疗AD 的具体机制还需进一步研究。