艾奇渊 王 勇 徐瑞春 彭 臻 李劲松 （贵州医科大学第三附属医院神经外科，都匀 558000）

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage， SAH）指脑底部或表面病变血管破裂，血液直接流入蛛网膜引起的临床综合征，虽然血管介入技术等治疗方法已取得很大进展，但SAH 患者预后仍不乐观，早期脑损伤是SAH 患者死亡的主要原因［1-2］。苦荞是双子叶蓼科荞麦属植物的成熟种子，其生物黄酮含量尤为丰富［3］。黄酮是广泛存在于植物界的酚类组分，因其减少自由基形成和清除存在自由基的抗氧化生物活性而在抗肿瘤、抗炎和心血管疾病治疗方面显示出卓越的治疗效果［4-5］。研究表明，氧化应激在SAH 患者脑死亡的发病机制中发挥关键作用，出血后产生的过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）能够激活相关信号通路，导致细胞凋亡［6］。神经炎症以炎症细胞和炎症细胞因子增加为主要标志，是介导SAH 后早期脑损伤的另一发病机制［7］。因此有效控制SAH 患者神经炎症，减缓脑组织氧化应激反应，对预防早期脑损伤具有重要意义。核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路长久以来被认为是典型的炎症信号转导通路，在表达炎症基因中占有枢纽性地位［8］。此外，研究发现多种心脑血管疾病与氧化应激和NF-κB信号通路激活有关［9］。本研究通过探索苦荞黄酮提取物对SAH 模型大鼠NF-κB 等信号通路的影响，以期为防治SAH患者早期脑损伤提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级新生Sprague-Dawley大鼠60 只，雌雄各半，体质量200～250 g，购自贵州中医药大学（实验动物研究所），动物许可证号：SCXK（黔）2021-0003。本研究经贵州医科大学第三附属医院动物实验伦理委员会审核通过（批准号：202105001）。

1.1.2 主要试剂 伊文思蓝染色液购自北京伊塔生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）检测试剂盒均购自南京赛泓瑞生物科技有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 检测试剂盒均购自上海宾智生物科技有限公司；苦荞黄酮提取物由南京道斯夫生物科技有限公司提供；基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、p-ERK、NF-κB P65 和p-NF-κB P65 单克隆抗体均购自Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 试剂盒均购自上海碧云天公司。

1.1.3 主要仪器 Perkin Elmer XElx800 型多功能酶标检测仪；拓赫Tissuelyser-192 多样品组织匀浆机；日立F-7000 型荧光分光光度计；Bio-Rad mini PROTEAN蛋白电泳仪和转膜仪。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、苦荞黄酮提取物低、中、高剂量组，每组10 只。将动物饲养在25 ℃、50%湿度、充满聚乙烯和12 h/12 h光/暗交替的人造环境中自由饮食，7 d适应环境。

模型组、尼莫地平组和苦荞黄酮提取物低、中、高剂量组大鼠采用血管内穿刺法建立SAH 模型［10］：通过腹腔注射2.5%戊巴比妥钠溶液（45 mg/kg）麻醉，成功后仰卧固定至手术板上，75%乙醇消毒颈部皮肤，做颈部正中切口，分离暴露右侧颈部动脉、颈内动脉和颈外动脉，将4-0 尼龙线头从颈外动脉残端插入右颈内动脉，穿透大脑前、中动脉分叉处。假手术组大鼠仅在手术操作过程中将尼龙线头端送至右颈内动脉，但不刺破动脉管壁。

麻醉复苏2 h 后，苦荞黄酮提取物低、中、高剂量组和尼莫地平组大鼠分别灌胃苦荞黄酮提取物（250 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg）和 尼 莫 地 平（0.2 mg/kg），模型组和对照组大鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃7 d［11-12］。

1.2.2 标本采集 取各组大鼠尾静脉血2 ml，4 ℃、1 000 r/min 离心20 min，取上层血清，储存于-80 ℃冰箱保存待测。末次干预后，2.5%戊巴比妥钠溶液深度麻醉后处死大鼠，断头剥离大鼠大脑皮质组织，剪取约0.5 g 于4 ℃下加入pH=7.4的PBS中充分洗涤，随后加入蛋白裂解液，将标本充分研成匀浆，4 ℃、1 000 r/min 离心20 min，收集上清液，储存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3 大鼠神经功能缺损评分 从给药结束24 h开始，根据大鼠活动情况，每日按照Longa 分级标准对各组大鼠神经功能进行评分［13］，0 分表示神经功能正常；1 分为轻度神经功能缺损，表现为对侧前爪不能完全伸展；2 分为轻中度神经功能缺损，行走时向对侧转圈；3 分为中度神经功能缺损，表现为行走时身体向对侧倾斜；4 分为中重度神经功能缺损，大鼠无法自发行走，意识减退；5 分为重度神经功能缺损，大鼠发生缺血相关性死亡。

1.2.4 脑含水量测定 末次给药后，每组采用2.5%戊巴比妥钠溶液麻醉处死3 只大鼠，迅速低温取脑，去除小脑、脑干和软脑膜等组织后，称量湿重，然后置于85 ℃烤箱烘烤至恒重，称量干重，通过公式：脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%，计算各组大鼠脑含水量。

1.2.5 血脑屏障通透性 各组取3只大鼠，经股静脉注射2%伊文思蓝染料（5 ml/kg），1 h后采用2.5%戊巴比妥钠溶液麻醉处死。迅速取出大脑，60 ℃甲酰胺中浸泡24 h，搜集大脑浸出液，采用荧光分光光度计检测伊文思蓝含量。

1.2.6 ELISA 检测大鼠血清炎症因子水平 取1.2.2 项下各组大鼠血清，ELISA测定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，严格按照试剂盒说明书包被酶标板，每孔50 µl，4 ℃静置过夜。将包被好的酶标板用PBS 缓冲液冲洗3 次，缓冲液封闭，每孔100 µl，37 ℃下放置30 min。封闭好的板加标准品或待测组织匀浆各3孔，每孔50 µl，室温放置4 h，每孔加入50 µl酶标抗体，室温反应1 h，加入底物邻苯二酚胺1 滴显色，待标准曲线梯度明显时用硫酸终止反应，读取490 nm下光密度值。

1.2.7 ELISA 检测大鼠大脑皮质组织中炎症因子水平 取1.2.2项下各组大鼠大脑皮质匀浆，ELISA检测其中炎症因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，严格按试剂盒说明书进行测定，详细方法见1.2.6。

1.2.8 大脑皮质组织中氧化应激水平 取1.2.2项下各组大鼠大脑皮质匀浆，ELISA 检测其中SOD、MDA 和GSH-Px 水平，严格按试剂盒说明书进行测定，详细方法见1.2.6。

1.2.9 Western blot 检测大鼠大脑皮质组织NF-κB/ERK 通路相关蛋白表达 取1.2.2项下各组大鼠大脑皮质匀浆，离心取上清液，按照BCA 试剂盒说明书步骤测得总蛋白浓度，将各组蛋白浓度调至相同。然后取同体积蛋白样品液进行SDS-PAGE 电泳，分离蛋白，电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室温下将膜与5%脱脂奶粉封闭孵育，获得目的蛋白条带，加入MMP-9、ERK、p-ERK、NF-κB P65 和p-NF-κB P65（1∶2 000）一抗4 ℃孵育过夜。洗膜，使用辣根过氧化物酶偶联的二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，洗膜，电化学发光显像，以GAPDH 作为内参，采用凝胶图像分析系统对比条带强弱，获得各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件对所得数据进行分析，满足正态分布的计量资料均以±s表示，采用单因素方差分析比较多组间差异性，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦荞黄酮提取物对大鼠神经功能缺损评分的影响 与模型组相比，尼莫地平组和苦荞黄酮提取物中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分明显下降（P＜0.01）；与苦荞黄酮提取物低剂量组大鼠相比，尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分（±s，分）Tab.1 Scores of neurological deficits of rats in each group （±s，score）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分（±s，分）Tab.1 Scores of neurological deficits of rats in each group （±s，score）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Scores of neurological deficits 0 3.45±0.57 0.48±0.161）2.71±0.39 1.67±0.351）0.57±0.161）

2.2 苦荞黄酮提取物对大鼠脑含水量和血脑屏障通透性的影响 与模型组大鼠相比，尼莫地平组和苦荞黄酮提取物中、高剂量组大鼠脑含水量和伊文思蓝渗出量明显下降（P＜0.01）；与苦荞黄酮提取物低剂量组大鼠相比，尼莫地平组大鼠脑含水量和伊文思蓝渗出量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠脑含水量和血脑屏障通透性比较（±s）Tab.2 Comparison on water content of brain and permeability of blood-brain barrier of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠脑含水量和血脑屏障通透性比较（±s）Tab.2 Comparison on water content of brain and permeability of blood-brain barrier of rats in each group（±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Water content of brain/%Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 69.42±1.77 77.73±2.75 72.08±1.771）Exudation volume of Evans blue dye/（ng·mg-1）3.13±0.56 15.03±2.42 4.78±0.861）76.95±2.25 11.45±1.94 74.07±1.981）8.39±1.701）72.57±1.641）4.88±0.921）

2.3 苦荞黄酮提取物对大鼠血清炎症因子水平的影响 ELISA 检测结果显示，与模型组相比，苦荞黄酮提取物中、高剂量组和尼莫地平组大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明显降低（P＜0.01）；与苦荞黄酮提取物低剂量组大鼠相比，尼莫地平组大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 苦荞黄酮提取物对大鼠血清炎症因子水平的影响（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of serum inflammatory factors of rats（±s，pg/ml）

表3 苦荞黄酮提取物对大鼠血清炎症因子水平的影响（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of serum inflammatory factors of rats（±s，pg/ml）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract TNF-α 42.37±4.21 109.02±9.02 46.82±3.941）IL-6 31.20±3.60 78.67±6.39 40.51±3.701）IL-1β 21.93±2.97 55.49±5.93 30.18±2.891）89.64±7.86 65.39±6.29 49.12±5.41 66.25±5.981）53.06±4.701）41.17±5.631）47.67±4.891）41.40±3.611）31.82±4.461）

2.4 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织中炎症因子水平的影响 ELISA 检测结果显示，与模型组相比，苦荞黄酮提取物中、高剂量组和尼莫地平组大鼠大脑皮质组织中TNF-α、IL-6和IL-1β 水平明显降低（P＜0.01）；与苦荞黄酮提取物低剂量组大鼠相比，尼莫地平组大鼠大脑皮质组织中TNF-α、IL-6 和IL-1β水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织中炎症因子水平的影响（±s，pg/ml）Tab.4 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of inflammatory factors in brain cortex of rats （±s，pg/ml）

表4 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织中炎症因子水平的影响（±s，pg/ml）Tab.4 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of inflammatory factors in brain cortex of rats （±s，pg/ml）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model TNF-α 6.57±1.43 22.01±2.77 IL-6 15.88±2.81 54.59±5.84 IL-1β 13.71±2.44 39.76±5.11 Nimodipine 7.60±1.781）27.89±3.571）15.70±2.741）Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 17.38±2.55 44.61±3.98 31.62±4.36 12.51±1.661）37.26±3.511）25.72±3.981）8.01±2.341）28.50±3.731）16.86±2.901）

2.5 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织中氧化应激水平的影响 ELISA 检测结果显示，与模型组相比，苦荞黄酮提取物低、中、高剂量组和尼莫地平组大鼠大脑皮质组织中SOD 和GSH-Px 水平明显升高，MDA水平明显降低（P＜0.01）。见表5。

表5 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织中氧化应激水平的影响（±s）Tab.5 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on oxidative stress level in brain cortex of rats （±s）

表5 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织中氧化应激水平的影响（±s）Tab.5 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on oxidative stress level in brain cortex of rats （±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model SOD/（U·mg-1）112.57±2.33 61.35±1.44 MDA/（nmol·L-1）28.60±3.01 70.69±5.80 GSH-Px/（U·L-1）92.08±6.34 50.18±5.62 Nimodipine 104.81±2.531）31.06±3.101）82.60±8.231）Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 78.22±2.171）62.74±5.281）53.67±6.201）84.76±1.561）47.33±4.691）62.46±6.881）98.40±2.371）34.88±3.781）73.04±7.701）

2.6 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织NF-κB/ERK 通路相关蛋白表达的影响 如图1、表6 所示，与模型组相比，苦荞黄酮提取物中、高剂量组和尼莫地平组大鼠大脑皮质组织中MMP-9、p-ERK/ERK和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平均明显降低（P＜0.01）；与苦荞黄酮提取物低剂量组大鼠相比，尼莫地平组大鼠大脑皮质组织中MMP-9、p-ERK/ERK 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 Western blot 检测大鼠大脑皮质组织NF-κB/ERK通路相关蛋白表达Fig.1 Expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats detected by Western blot

表6 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织NF-κB/ERK 通路相关蛋白表达的影响（±s）Tab.6 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats （±s）

表6 苦荞黄酮提取物对大鼠大脑皮质组织NF-κB/ERK 通路相关蛋白表达的影响（±s）Tab.6 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats （±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups MMP-9 p-ERK/ERK Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 0.22±0.04 1.36±0.19 0.34±0.061）0.16±0.05 0.79±0.15 0.23±0.051）p-NF-κB P65/NF-κB P65 0.04±0.01 0.38±0.04 0.08±0.041）1.22±0.13 0.60±0.10 0.35±0.05 0.63±0.101）0.45±0.101）0.21±0.041）0.34±0.051）0.24±0.051）0.11±0.041）

3 讨论

SAH 是常见的脑部血管急症，其起病迅速，致死致残率高，常引起颅内压升高、血脑屏障受损、脑水肿等脑部损伤［14］。临床研究表明，尼莫地平在脑血管舒张作用方面具有较强的生物学活性，能够通过血脑屏障进入脑组织发挥增加脑组织供血量、改善脑缺氧和修复受损脑神经等作用，使用尼莫地平治疗SAH 患者也在临床上取得了良好成效［15］。通过对比尼莫地平和苦荞黄酮提取物对SAH 大鼠的治疗效果及对ERK/NF-κB 信号通路的抑制作用，一定程度上能够评估苦荞黄酮提取物的临床效应和调控SAH 大鼠脑组织神经炎症和氧化应激的作用机制。本研究结果显示，与模型组相比，尼莫地平组和苦荞黄酮提取物中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分、脑含水量和伊文思蓝渗出量明显下降。提示适宜浓度的苦荞黄酮提取物能够促进SAH 大鼠神经功能恢复，减轻脑水肿，修复血脑屏障，并显示出剂量依赖性。

本研究结果显示，与模型组相比，苦荞黄酮提取物中、高剂量组和尼莫地平组大鼠血清及大脑皮质组织中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明显下降，且随剂量升高作用增强。说明中、高剂量苦荞黄酮提取物能够有效降低炎症因子水平，SAH 所致的脑损伤的主要致病机制为蛛网膜下腔涌入大量血液，反应生成大量ROS，诱导TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎症因子过表达，这类炎症因子产生的趋化作用能够介导中性粒细胞迁移和血管内皮细胞黏附，炎症细胞向出血部位迁移，促使神经炎症发生发展［16-17］。因此，苦荞黄酮提取物能够通过抑制SAH 引发的炎症，发挥促进神经功能恢复的治疗效果。此外，大量ROS引发脂质过氧化和DNA损伤，最终导致脑水肿和脑神经细胞死亡，同时自由基通过改变血管通透性，进一步损伤脑组织，是SAH 早期脑损伤的另一重要致病因素［18］。SOD 将超氧化物自由基转化为H2O2，从而保护细胞不受氧自由基损伤，MDA 则是脂质过氧反应的终产物，可与核酸等大分子化合物交联，影响线粒体活性，产生细胞毒性，二者常用作反映氧化损伤的指标。GSH-Px 能够将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2分解，保护细胞膜结构与功能不受过氧化物的干扰及损害，其水平越高说明体内氧化应激水平越低，细胞功能越完善。既往研究发现，当机体氧化和抗氧化稳态失衡后，会形成氧化应激状态，产生过量ROS 分子，造成细胞凋亡［19］。本研究结果显示，苦荞黄酮提取物低、中、高剂量组和尼莫地平组大鼠大脑皮质组织中SOD 和GSH-Px 水平较模型组明显上升，MDA 水平明显下降。说明苦荞黄酮提取物能够通过调节机体氧化应激水平，中断SAH 引起的脑细胞损伤的快速级联反应，促进神经功能恢复，修复SAH患者早期脑损伤。

SAH 发生后，ERK 信号被激活发生磷酸化，介导细胞凋亡、免疫炎症反应等病理生理过程。既往研究表明，氧化应激、细胞因子和组织出血均能够激活NF-κB 信号通路，使之磷酸化，并由胞质转移至胞核，迅速调控相关基因转录和MMP-9 等下游蛋白水平，产生过度炎症反应，引起组织和细胞损伤，抑制NF-κB 长久以来一直是研究新型抗炎药物的风向标，通过抑制ERK 和NF-κB 信号通路，能够抑制脑组织中炎症水平，从而减轻脑损伤［20-21］。Western blot 检测结果显示，苦荞黄酮提取物中、高剂量组大鼠大脑皮质组织中MMP-9、p-ERK/ERK 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平均明显低于模型组。说明苦荞黄酮提取物可有效抑制ERK/NF-κB 信号通路相关蛋白表达，通过抑制ERK/NF-κB 信号通路可调节氧化应激和炎症水平，修复脑损伤，发挥神经系统保护作用。

综上所述，苦荞黄酮提取物通过抑制ERK/NF-κB信号通路调控相关蛋白表达，减轻氧化应激与炎症反应，进一步抑制脑组织神经元细胞凋亡，减轻SAH 早期脑损伤症状。该研究能够为阐明苦荞黄酮提取物治疗SAH 早期脑损伤的作用机制提供理论支持，将为临床诊断治疗SAH提供新思路。