杨潇湘,张 蕾,张重梅,黄小琴,胡孜进,余垚颖,邓 越,鲜赟曦,周西全,刘 勇*

(1.四川省农业科学院植物保护研究所,成都 610066;2.农业农村部西南作物有害生物综合治理重点实验室,成都 610066)

苹果(Malusdomestica)属于蔷薇科苹果亚科苹果属,营养价值高,维生素、矿物质含量丰富。盐源苹果作为盐源县主导产业,果皮薄而肉嫩、口感香甜脆,果大色鲜味美,近年来在市场上有着无限潜力[1]。目前来看,苹果树腐烂病[2]、重茬病[3]、早期落叶病,特别是早期落叶病是影响苹果树抗性和苹果质量的重大病害。

早期落叶病是一种由真菌引发的病害,易发生于高温高湿的环境下。真菌可通过分生孢子或以菌丝体的形式盘在去年的落叶上越冬,翌年春雨后菌丝体产生分生孢子,孢子可利用雨水等传播。苹果树叶片在感染此类疾病之后,造成苹果叶片在前期大批量掉落,消减树势,并且引发二次开花、越冬芽萌发,对翌年苹果的产量和品质影响极大,部分还会造成苗木损伤,降低苗木对病害的抗性。苹果早期落叶病在我国西北黄土高原产区、渤海湾产区、黄河故道和秦岭北麓产区、西南冷凉高地产区均有发生。

我国对苹果早期落叶病十分重视。肖猛等[4]、杨文渊等[5]都做过早期落叶病的相关调查并提出了防治措施。与苹果落叶病相关的探究也比较多,但关于盐源苹果落叶病的报道较少。所以该试验对盐源苹果早期落叶病的病原菌展开探究,以期找到更多更细致的关于病原菌的信息,为苹果早期落叶病的防治提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基(去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000mL);Czapek培养基(NaNO33.0g,K2HPO41.0g,MgSO4.7H2O 0.5g,KCl 0.5g,FeSO40.01g,蔗糖30g,琼脂20g,蒸馏水1000mL)。

苹果病叶采自四川省凉山彝族自治州盐源县。

1.2 病原菌的分离与纯化

将收集回来的病斑叶子拍照记录并进行处理,剪取病斑与健康部分交界处,分成5mm×5mm的小块,放在75%的酒精中消毒30s,消毒后用灭菌过的蒸馏水漂洗3次,然后放于灭菌的滤纸上擦干水分,转到加了氨苄青霉素的PDA培养基上,置于25℃的恒温培养箱中培养[6]。待病菌长出来后,及时将病菌挑出来转到新的培养基上培养,直到培养出纯净的病菌。把纯化过后的病原菌接到准备好的10mL PDA试管斜面里面,放到4℃的冰箱中进行菌种保存。

1.3 病原菌形态观察

用直径为5.0mm的打孔器在菌落边缘取菌块,接种于PDA培养基,置25℃恒温培养箱进行培养。待菌落长出来后,记录菌落形态、色泽等数据,并在显微镜下观察孢子的类型、大小等特征。

1.4 病原菌的DNA鉴定和rDNA-ITS序列分析

在得到纯净的病原菌后,就进行病原菌的DNA鉴定。使用M5 Fungal Genomic DNA kit试剂盒进行DNA提取,随后进行rDNA-ITS序列分析,使用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增[7],25μL PCR反应体系为:ITS1和ITS4各1.0μL,2×PCR HeroTMMix12.5μL,ddH2O 9.5μL,病原菌DNA 1.0μL。PCR程序如下:94℃下预变性3min,94℃下变性20s、57℃下退火20s、72℃下延伸30s,共35个循环,最后72℃下延伸5min[8]。得到的PCR原液送到成都擎科生物技术公司进行序列测定,把测得的序列放到NCBI官网上进行BLAST序列比对。

1.5 生物学特性研究

把冰箱里放的病原菌进行菌种活化,从试管中挑一个菌块放到PDA培养基上培养7d[9]。病原菌生长7d后,开展生物学特性研究实验,探究不同温度、不同碳源、不同氮源、不同光照对病原菌的生长影响。

1.5.1 不同温度对病原菌生长的影响 将刚灭菌的PDA培养基倒入直径为9cm的培养皿中,待凝固后,在菌落边缘取5.0mm的菌块,倒放在新的培养基中央。放入温度设置为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒温培养箱中,每个处理3个重复。每天记录病菌生长状况并用直尺使用十字交叉法量菌块生长的总直径[10],结果取用两次量取的平均值。7d后,进行数据整理。

1.5.2 不同碳源对病原菌生长的影响 以Czapek培养基为样,将蔗糖替换成相同质量的果糖、葡萄糖、淀粉,对照组则加2g/L的NaCl,除此不添加其他碳源。

1.5.3 不同氮源对病原菌生长的影响 以Czapek培养基为样,将NaNO3替换成相同质量的KNO3、NH4NO3、牛肉膏,对照组不加任何氮源,加2g/L的NaCl。

1.5.4 不同光照对病原菌生长的影响 在菌落边缘取直径为5.0mm的菌块,倒放在新的PDA培养基中央。每组3个重复,分别放入恒温为25℃的24h光照、24h黑暗和12h光照12h黑暗的光照培养箱中培养,按照1.4.1的方法来测量。

2 结果与分析

2.1 早期落叶病的症状

通过对盐源苹果早期落叶病的调查发现,叶子在患病之后,先会出现紫红色或者黑色斑点。随着时间增长,斑点变大,斑点中间叶片开始干枯泛白或长出细小的黑斑,叶片此时也会随之枯黄并大量掉落,少数叶柄上还会覆盖一层白毛。

2.2 病原菌的形态鉴定

通过形态学和分子生物学鉴定,共分离出37株盐源苹果早期落叶病的病菌,主要有链格孢菌(Alternariaspp.)(86.48%)、雅致放射毛霉(Actinomucorelgans)(5.41%)、稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)(5.41%)和黒附球菌(Epicoccumnigrum)(2.70%)等,从中选取具有代表性的链格孢菌菌株AL47、雅致反射毛霉菌株AL91、稻黑孢菌菌株AL77、黒附球菌菌株AL21来进行形态描述与生物学实验。

链格孢菌AL47菌株生长初期,菌丝为白色,生长缓慢,菌丝均匀的向四周生长呈圆形,生长到中后期时,菌丝逐渐由白色变成灰黑色,整体呈显为绒毛状,菌落背面为均匀的黑褐色。其分生孢子为倒棒状或喙柱状,颜色为灰黑色或淡褐色,有6～10个横隔,0～4个纵隔。

雅致反射毛霉菌AL91生长初期长出的是灰褐色菌丝,生长较慢,均匀向四周铺开呈圆形,菌落的背面则是为灰褐色,分生孢子为球形。

图3 雅致反射毛霉菌AL91的形态特征

稻黑孢菌AL77生长初期菌丝大多为半透明的白色且细长,生长较快,顶端菌丝长得极快且不均匀,生长到后期,菌落质地疏松呈絮状,菌落背面为黑褐色。分生孢子呈黑色圆形,表面光滑。

图4 稻黑孢菌菌AL77形态特征

黒附球菌AL21生长初期,菌丝为白色,生长较慢,随着生长菌丝变成橙黄色,菌落背面是橙黄色。分生孢子球形网格状,无色或淡褐色,从分生孢子梗顶端膨大处生出。

图5 黒附球菌AL21的形态特征

2.3 不同温度对病原菌生长的影响

4种病原菌在不同温度下培养7d后,记录的菌落生长总直径如表1所示。4种病原菌在温度为5℃时,菌丝生长都极不明显,几乎处于休眠不生长状态,在10～35℃都能生长。

表1 不同温度对病原菌生长的影响

链格孢菌生长的最适温度为30℃,平均直径为8.5cm;雅致放射毛霉在30℃和25℃生长均比较快,平均直径分别为7.2cm和7.1cm;稻黑孢菌在10～25℃时均较宜生长,最适温度为25℃;黒附球菌生长的最适温度为25℃,平均直径为6.4cm。

2.4 不同碳源对病原菌生长的影响

4种病原菌在不同碳源环境中培养7d天后,所得到的的菌落生长总直径如表2所示。4种菌在不同碳源环境中都能生长,在没有碳源的情况下也能生长,但是菌丝比较纤细呈半透明色,分布十分稀疏。

表2 不同碳源对病原菌生长的影响

芸苔链格孢、稻黑孢菌在碳源为葡萄糖的情况下生长最快,在第7d时平均直径8.5cm。雅致放射毛霉在碳源为淀粉时,菌丝生长速度最快,其平均直径7.2cm。黒附球菌在碳源是果糖的环境下时,菌丝生长最快,平均直径7.8cm。

2.5 不同氮源对病原菌生长的影响

4种病原菌经7d培养,其在不同氮源环境下的生长直径如表3所示。牛肉膏是4种病原菌的最适氮源。在氮源来源不同和没有氮源的情况下,病原菌都能够生长,但在没有氮源的情况下,菌丝极细且不均匀,雅致放射毛霉在氮源为NH4NO3时,生长较慢,但是菌丝浓密,菌落形状规则为圆形。

表3 不同氮源对病原菌生长的影响

2.6 不同光照对病原菌生长的影响

经过7d的培养,4个病原菌在不同光照条件下生长总直径数据如表4所示。芸苔链格孢在24h光照的条件下生长最好,平均直径为7.7cm。雅致放射毛霉在光照12h黑暗12h的条件下生长最迅速,平均直径为6cm。稻黑孢菌在各光照条件下均生长较好,但在全黑条件下的菌丝最浓密均匀。黒附球菌在24h黑暗条件下生长最迅速,平均直径为5.7cm。

表4 不同光照对病原菌生长的影响

3 讨论与结论

对患病叶子的病原菌进行组织分离提纯与鉴定得出,引起盐源苹果早期落叶病的病原菌较多,主要有链格孢菌、雅致放射毛霉、稻黑孢菌、黒附球菌等。生物学特性研究试验进一步探究了4种病原菌在不同环境下的生长状态,为进一步控制早期落叶病奠定了理论基础。

由生物学特性研究试验可知,4种病原菌在10～35℃都能正常生长。除雅致放射毛霉最合适的温度为30℃外,其余3种病原菌的最适温度为25℃。通过不同碳源试验可知,芸苔链格孢和稻黑孢菌在碳源为葡萄糖的情况下生长最好;雅致放射毛霉在淀粉为碳源时,生长最好;黒附球菌的最适碳源为果糖。牛肉膏是4种病原菌的最适氮源,表明4种菌在对氮源的要求上存在相似性。光照试验表明,4种病原菌更适应黑暗的坏境,在光照条件少的情况下生长更加旺盛。由以上试验结果可知,病原菌能正常生长,对周围环境条件的要求是多样的。在后期研究中,可根据病原菌的生物学特性,来进行相关的抑制防治试验。

综上,研究确定了引起盐源苹果早期落叶病的病菌主要有芸苔链格孢、雅致放射毛霉、稻黑孢菌和黒附球菌等,并初步明确这些病原的生物学特性。