刘馨联，庄江超，周心行，汤纪航，张胜元，王 洁

（浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022）

相较于陆生的动植物，海洋生物长期生活在高压、高盐、低温和寡营养的环境中，有着独特的代谢途径，极大地增加了其产生奇特结构的可能。海绵缺乏物理防护，但在海洋中却很少被捕食也几乎不被细菌分解，这与其体内强大的化学防御机制有关。随着海绵中大量生物活性物质的发现，海绵已成为海洋天然药物的重要来源，对海绵生物活性物质的研究已成为海洋药物开发的热点。

简易扁板海绵（Plakortis simplex）为寻常海绵纲（Demospongiae）同骨海绵目（Hamosclerophorida）多板海绵科（Plakinidae）动物，其次级代谢产物的结构丰富多样，包括聚酮类、生物碱类、呋喃类和萜类等，且大多具有显著的生物活性，例如抗疟、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎和免疫调节等［1］。萜酚类化合物广泛存在于海洋生物中，通常表现出显著的抗肿瘤、抗菌和抗疟等活性［2-7］，但在简易扁板海绵中存在较少。试验前期已从该海绵中发现了6 种新化合物，但因化合物量较少未做进一步的活性研究［8］。本次研究通过LC-MS 法和HPLC 法对该海绵中的萜酚类化合物进行追踪富集和分离，运用MTT 法和荧光素酶双报告基因检测法评价萜酚类化合物的抗肿瘤活性和抗炎活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海绵样品于2007 年5 月采自中国南海西沙群岛，由青岛海洋研究所李锦和研究员鉴定为Plakortis simplex。标本（No. B-3）存放于上海交通大学医学院附属仁济医院海洋药物重点实验室。人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞Hela、人肾上皮细胞293T，均由厦门大学提供。

9-顺视黄酸（美国Sigma Chemical 公司）；TNF-a（美国Peprotech 公司）；Lipofectamine® 2000 Reagent（美国Invitrogen 公司）；Dual-Luciferase®Reporter Assay System 10-Pack（美国Promega 公司）；色谱级甲醇（美国Promptar 公司）；氘代试剂CD3OD（剑桥同位素实验室有限公司）。

1.2 仪器与设备

Waters Xevo G2-XS Q-Tof 液质联用仪（美国Waters 公司）；Waters 1525/2998 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；YMC-Pack Pro C18色谱柱（250×10 mmI.D.S-5 μm，8 nm，日本YMC 公司）；中压色谱仪（Interchim puriflash 450 instruments，法国Interchim 公司）；Agilent DD2-600 型核磁共振仪（美国Agilent 公司）；Glomax20/20 化学发光检测仪（美国Promega 公司）；Model 680 酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 萜酚类化合物的追踪分离 采用高分辨液质联用仪分析海绵（Plakortis simplex）的正丁醇萃取物经前期分离得到的各组分，在负离子模式下追踪相对分子质量为249.149 的分子离子峰，并进行组分富集得到组分H（4.3 g）。组分H 通过反相硅胶柱色谱（流速：10 mL/min，流动相：10%～100%甲醇水溶液）分离得到6 个组分：1—6。采用LC-MS 法分析发现组分2（0.55 g）和组分3（0.32 g）中含有相对分子质量为249.149 的分子离子峰，组分2 经高效液相色谱（流速：2.0 mL/min，流动相：40%甲醇水溶液）分离得到化合物4（4.5 mg）、3（6.1 mg）、6（3.8 mg）和5（3.6 mg）；组分3 经高效液相色谱（流速：2.0 mL/min，流动相：40%甲醇水溶液）分离得到化合物2（3.2 mg）、1（3.1 mg）、8（15.0 mg）和7（13.3 mg）。

1.3.2 单体化合物的细胞毒活性评价 参考文献［9］，采用MTT 法对分离得到的化合物进行细胞毒活性评价。选用人乳腺癌细胞系MCF-7 和人宫颈癌细胞系Hela 进行活性评价，样品终浓度为20 μmol/L。

1.3.3 双荧光素酶报告基因检测化合物与RXRα 的相互作用 293T 细胞接种于培养皿中，待细胞密度为80%时转染质粒（pG5luc∶pBIND-RXRa-LBD∶lipo2000=10 μg∶3 μg∶20 μL），12 h 后消化细胞并接种到96 孔板，继续培养12 h 待细胞贴壁后，分别用20 μmol/L 的样品或9-顺视黄酸单独处理以及9-顺视黄酸联合20 μmol/L 的样品处理细胞，每组重复2次。12 h 后收集细胞，并裂解，加入荧光素酶底物分别检测萤火虫素酶和海肾荧光素酶的活性，并计算萤火虫荧光素酶的相对活性。

1.3.4 双荧光素酶报告基因检测化合物对TNF-α诱导的NF-κB 的影响 293T 细胞接种于培养皿中，待细胞密度为80% 时转染质粒（pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］∶Rellina∶lipo2000=10 μg∶0.5 μg∶20 μL），12 h 后消化细胞并接种到96 孔板，继续培养12 h 待细胞贴壁后，对照组不做处理，模型组加20 ng/mL 的TNF-α，阳性对照组加20 ng/mL 的TNFα 和0.5 μmol/L 的TPCA，试验组加20 ng/mL 的TNFα 和20 μmol/L 的样品，每组做2 个复孔。6 h 后收集细胞并裂解，加入荧光素酶底物分别检测萤火虫素酶和海肾荧光素酶的活性，并计算萤火虫荧光素酶的相对活性。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

从简易扁板海绵的正丁醇萃取物中共分离8 个单体化合物（图1），与前期分离得到的萜酚类化合物进行对比［8］，化合物1—6 分别鉴定为Plakordiol A（1）、Plakordiol B（2）、Plakordiol C（3）、Plakordiol D（4）、（7R，10R）-Hydroxycurcudiol（5）、（7R，10S）-Hydroxycurcudiol（6）。

图1 萜酚类化合物1—8 的结构

化合物7：黄色油状，易溶于甲醇。10%硫酸-香草醛显色呈深蓝色。ESIMS 给出准分子离子峰m/z233.14［M - H］-，分子式为C15H22O2，计算不饱和度为5。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.94（1H，d，J= 7.8 Hz，H-5），6.60（1H，br d，J= 7.8 Hz，H-4），6.58（1H，br s，H-2），4.87（1H，br s，H-12），4.77（1H，br s，H-12），3.96（1H，t，J=6.6 Hz，H-10），3.10（1H，m，H-7），2.22（3H，s，H-15），1.63（3H，s，H-13），1.57（2H，m，H-8），1.50（1H，m，H-9），1.40（1H，m，H-9），1.17（3H，d，J= 7.2 Hz，H-14）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δC：155.6（C，C-1），148.8（C，C-11），137.1（C，C-3），131.4（C，C-6），127.6（CH，C-5），121.3（CH，C-4），116.7（CH，C-2），111.6（CH2，C-12），77.2（CH，C-10），34.4（CH2，C-8），34.0（CH2，C-9），32.9（CH，C-7），21.8（CH3，C-14），21.1（CH3，C-15），17.3（CH3，C-13）。以上核磁数据与文献报道的（7R*，10R*）-Abolene 的核磁数据基本一致［10］，确定该化合物为（7R*，10R*）-Abolene。

化合物8：黄色油状，易溶于甲醇。10%硫酸-香草醛显色呈深蓝色。ESIMS 给出准分子离子峰m/z233.14［M - H］-，分子式为C15H22O2，计算不饱和度为5。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.95（1H，d，J= 7.8 Hz，H-5），6.60（1H，br d，J= 7.8 Hz，H-4），6.58（1H，br s，H-2），4.87（1H，br s，H-12），4.78（1H，br s，H-12），3.99（1H，t，J=6.6 Hz，H-10），3.13（1H，m，H-7），2.22（3H，s，H-15），1.65（1H，m，H-8），1.63（3H，s，H-13），1.53（1H，m，H-8），1.50（1H，m，H-9），1.40（1H，m，H-9），1.18（3H，d，J= 7.2 Hz，H-14）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δC：155.6（C，C-1），148.9（C，C-11），137.1（C，C-3），131.4（C，C-6），127.7（CH，C-5），121.3（CH，C-4），116.6（CH，C-2），111.6（CH2，C-12），76.7（CH，C-10），34.1（CH2，C-8），33.9（CH2，C-9），32.5（CH，C-7），21.8（CH3，C-14），21.1（CH3，C-15），17.6（CH3，C-13）。以上核磁数据与文献报道的（7R*，10S*）-Abolene 的核磁数据基本一致［10］，确定该化合物为（7R*，10S*）-Abolene。

2.2 细胞毒活性

采用MTT 法对8 个单体化合物进行人乳腺癌细胞MCF-7 和人宫颈癌细胞Hela 细胞抑制活性评价，结果见图2。在20 μmol/L 浓度下，8 个化合物均对MCF-7 细胞的生长表现出一定的抑制活性，尤其是化合物3 和4 的活性最强，细胞生长率分别为71%和73%；化合物1、3、4、7 和8 对Hela 细胞表现出较好的抑制活性。结果表明，化合物3 的细胞毒活性最强。

图2 化合物1—8 对MCF-7 和Hela 细胞的生长抑制活性

2.3 对9-顺视黄酸诱导的RXRα 转录活性的影响

采用双荧光素酶报告基因检测化合物对9-顺视黄酸诱导的类视黄醇X 受体α（RXRα）转录的影响，结果如图3 所示。与模型组相比，化合物1 和化合物3 在20 μmol/L 浓度下可明显抑制RXRα 的转录激活活性（P＜0.05 或P＜0.01），而化合物4 则促进9-顺视黄酸激活RXRα 的转录活性（P＜0.01）。结果表明，化合物3 的抑制活性最强，其可能为RXRα 的拮抗剂或诱导RXRα 四聚化，从而表现出抑制RXRα转录激活活性；而化合物4 可能和9-顺视黄酸对RXRα 转录激活活性具有协同作用。

图3 化合物1—8 对9-顺视黄酸诱导的RXRα 转录活性的影响

2.4 对TNF-α 诱导的NF-κB 的影响

采用双荧光素酶报告基因检测化合物对TNFα 诱导的NF-κB 激活的影响，结果如图4 所示。与模型组相比，化合物1 在20 μmol/L 浓度下对TNF-α诱导的NF-κB 的激活表现出一定的抑制活性（P＜0.05）。因此，化合物1 可通过抑制NF-κB 的激活而发挥一定的抗炎作用。

图4 化合物1—8 对TNF-α 诱导的NF-κB 的影响

3 小结与讨论

采用LC-MS 法从简易扁板海绵（Plakortis simplex）中高效追踪萜酚类化合物，并运用HPLC 法分离得到8 个单体化合物，它们为4 对差向异构体。采用MTT 法和荧光素酶双报告基因检测法检测了萜酚类化合物的抗肿瘤活性和抗炎活性。结果表明，在20 μmol/L 浓度下，化合物3 表现出较好的细胞毒活性和抑制9-顺视黄酸诱导的RXRα 转录激活活性；化合物4 促进9-顺视黄酸激活RXRα 的转录活性，其与9-顺视黄酸对RXRα 转录激活活性表现出一定的协同作用。化合物1 对TNF-α 诱导的NFκB 的激活表现出一定的抑制活性，具有潜在的抗炎活性。

RXRα 在人体组织内广泛表达，参与了多种疾病的发生与发展，尤其是癌症，目前RXRα 已作为癌症药物研发的一个重要靶点［11］。根据小分子化合物对RXRα 调控作用的不同，分为激动剂和拮抗剂，两者均表现出抗肿瘤活性。9-顺视黄酸是RXRα 的天然激动剂，通过双荧光素酶报告基因检测小分子对9-顺视黄酸诱导的RXRα 转录的影响筛选潜在的抗肿瘤活性化合物。研究发现，化合物3 抑制RXRα 转录激活活性，而化合物4 与9-顺视黄酸对RXRα 转录激活活性发挥协同作用，两者对人乳腺癌细胞MCF-7 均表现出一定的生长抑制活性。有趣的是，化合物3 和化合物4 互为差向异构体，仅C-10 构型不同，但两者对RXRα 转录的影响却相反，这表明化合物3 和4 均可与RXRα 蛋白结合，但对蛋白的调控作用不同，因此，两者对RXRα 的调控机制和抗肿瘤作用机制有待进一步研究。