郭招娣，赵甜，许红霞，郭鑫，赵小君，谌宗永，马昂，刘宇晶，王明娟

北京阳光诺和药物研究股份有限公司，北京 102200

阿齐沙坦（azilsartan）是新一代选择性AT1 亚 型血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensin receptor blocker,ARBs）类抗高血压药，与血管紧张素转化酶抑制剂类降压药物相比，具有平稳降压及不会干咳的优点［1-2］。基因毒性杂质（genotoxic impurities）或致突变杂质（mutagenic impurities)，指在较低水平时也有可能直接引起DNA 损伤，导致DNA 突变，从而可能引发癌症的遗传毒性杂质，是影响用药安全的关键风险因素，需要重点关注［3-7］。基因毒杂质可能来源于原料药合成工艺中的起始原料、工艺中间体、反应副产物或溶剂、试剂、催化剂等［3］。根据本研究中使用的阿齐沙坦候选原料的合成路线，在步骤3 中使用了叠氮化钠，而步骤4 中又使用了4-溴甲基-2'-氰基联苯，有可能会与上一步骤中残留的微量叠氮化钠发生反应，如图1 所示，产生带警示结构的叠氮杂质AMBC｛4'-(azidomethyl)［1,1-biphenyl］-2-cyanyl，4'-(叠氮甲基)［1,1-联苯］-2-氰基｝，故需要对该杂质的残留风险进行评估。

图1 阿齐沙坦合成路线中AMBC杂质可能的产生途径示意图

叠氮化物通过抑制细胞色素C 氧化酶引起毒性效应，会导致头晕、低血压、代谢性酸中毒、呼吸抑制等，甚至死亡［8-12］，因此非常有必要对药品中叠氮化物的残留水平进行严格监控。本研究重点探讨AMBC 杂质残留水平的监控（叠氮化钠与AMBC结构差异较大，会采用另外一个系统监控）：AMBC属于带叠氮化警示结构的杂质、无致畸性报道、与药物活性成分阿齐沙坦的结构有较明显差异，按照人用药品注册技术国际协调会议（ICH）M7 分类原则，应归属为3 类基因毒性杂质［3］；按照ICH M7指南控制策略，需要将该类杂质的残留水平控制在毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）以下；按照最严苛的长期治疗方案（使用时间>10 年）、终生患癌风险为十万分之一假设，AMBC 杂质的TTC 值采用了1.5 μg/d，阿齐沙坦的每日最大用药剂量为40 mg，故阿齐沙坦中AMBC 的限度设定为37.5 ppm（即：1.5 μg/d÷40 mg/d×1 000 μg/mg=37.5 ppm）。

在痕量叠氮化物杂质的监控中，常采用离子色谱法［8-12］；在提升痕量叠氮化物的检测灵敏度方面，文献中曾报道了柱切换在线基体消除法［11］、磁化阴离子交换金属-有机骨架富集技 术（magnetized anion-exchange metal-organic frameworks）［12］、五氟苄基衍生-气相色谱（GC-MS）法［13］等。本研究首次成功采用灵敏度、专属性均很理想的串联质谱技术［14-17］，对阿齐沙坦原料中的痕量AMBC 残留风险进行了监控，以保障新药研发过程中所使用的阿齐沙坦原料及其制剂的用药安全。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-MS/MS 质谱仪（型号：API 4000，AB SCIEX公司）；超声波清洗器（KH-600，昆山禾创超声仪器有限公司）；十万分之一电子天平（AP225WD，日本岛津公司）。

1.2 试药、对照品和样品

水（蒸馏水，屈臣氏）；乙腈（色谱纯，MREDA 公司）；乙酸铵（色谱纯，MREDA 公司）；杂质AMBC 对照品（纯度99.6%，STD 公司）；阿齐沙坦原料（批号：C1011-200501，C1011-200502，C1011-200503，浙江宏元药业股份有限公司）；阿齐沙坦原料合成工艺步骤6 的工艺中间体C6 样品（属于目标杂质AMBC 产生后可能残留的关键工艺中间体，批号：Y9117-200401，Y9117-200402，Y9117-200403，浙江宏元药业股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件液相色谱：采用ACE Excel 3 C18 柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱温为40 ℃；流动相A 为0.01 mol/L 乙酸铵溶液-乙腈（90∶10），流动相B 为乙腈，梯度洗脱：0～6.0 min,20%→90% B；6.0～11.0 min,90% B；11.01 min，90%→20% B 并维持至16 min，总流速为0.5 mL/min，进样体积为10 μL。

质谱条件：采用API 4000 三重四极杆串联质谱仪，大气压化学电离-正离子扫描（APCI+），多反应监测模式（MRM），探头温度：450 ℃，电晕针电流：3.0 μA，气帘气：35 psi，碰撞气：4 psi，雾化气：45 psi；用杂质AMBC 的特征离子对207.3 →180.3 进行定量监测。

1.3.2 溶液配制（1）溶剂：采用80%乙腈。

（2）AMBC 对照品溶液：取AMBC 对照品约10 mg，精密称定，置于100 mL 量瓶中，加溶剂溶解并定容至刻度，摇匀；精密量取100 μL 置于100 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为AMBC 对照品溶液（约100 ng/mL，相当于供试品溶液浓度的33.3 ppm）。

（3）供试品溶液：取样品约30 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，混匀，即得（3 mg/mL）。

各溶液配制后，应置于冷藏条件下保存。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性取“1.3.2”项下的空白溶剂、AMBC对照品溶液、供试品溶液，依次进样分析，记录色谱图，见图2。结果显示：空白溶液与样品基质（阿齐沙坦的出峰时间约为7.3 min）均不会对目标杂质AMBC（保留时间约为9.3 min）的检测造成干扰，且AMBC 的峰形较好，证明拟定方法的专属性较好。

图2 典型LC-MS/MS图：A.空白溶剂；B.AMBC对照品溶液；C.样品溶液

2.1.2 定量限与检测限分别以信噪比（S/N）约为3 和10 作为AMBC 的检测限（LOD）与定量限（LOQ）判定标准。取AMBC 对照品溶液，用溶剂进行逐级稀释，确定的检测限（S/N 为6～7）约为0.062 ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.021 ppm），定量限（S/N 为12～16）约为0.21 ng/mL，相当于供试品溶液浓度的0.07 ppm，远低于AMBC 拟定限度（37.5 ppm），证明方法的检测灵敏度非常理想。

取定量限浓度水平的对照品溶液，重复进样，AMBC 峰面积的RSD 为2.8%（n=6），证明方法在定量限水平时的进样精密度较好。

2.1.3 进样精密度取“1.3.2”项下的AMBC 对照品溶液，重复进样6 针，AMBC 保留时间和峰面积的RSD 分别为0.1%和1.6%，证明方法的进样精密度较好。

2.1.4 重复性平行配制6 份100%限度水平的加标供试品溶液考察方法的重复性，结果表明：6 份样品中AMBC 杂质含量测定结果RSD 为1.5%，表明方法的重复性良好。

2.1.5 线性关系考察分别配制相当于“1.3.2”项下AMBC 对照品溶液浓度（100 ng/mL）10%、50%、100%、150%、200%和300%的溶液（实际浓度介于10.4～312.2 ng/mL 范围，相当于3.5～104.1 ppm），用“1.3.1”项下色谱条件考察方法的线性响应情况，结果表明：在能够覆盖拟定限度水平（37.5 ppm）的上述浓度范围内，杂质AMBC 的峰面积（Y）与溶液浓度（X）呈良好的线性响应，线性回归方程为Y=7 002X+16 571，r=0.999 8 。

2.1.6 准确度在杂质AMBC 限度（100 ng/mL）的50%、100%、150%三种添加水平下进行拟定LCMS/MS 方法的准确度考察，每种浓度水平分别平行配制三份溶液，加样回收率结果如表1 所示：9 份加标样品中，杂质AMBC 的加样回收率介于100.2%～104.2%，均在规定范围内［18］，证明样品溶液的前处理适宜、样品基质不会干扰目标杂质AMBC 的准确测定。

表1 用拟定方法测得的AMBC杂质的加样回收率结果

2.1.7 溶液稳定性将对照品溶液、100%加标供试品溶液在10 ℃条件下放置，分别在0、2、4、6、8、12 h进样分析，结果表明：上述2种溶液在12 h之内，杂质AMBC 峰面积的RSD%分别为1.79%和1.71%，说明两种溶液在10 ℃条件下，至少12 h 内稳定。

2.2 样品分析

利用上述经过验证的串联质谱方法对3 批阿齐沙坦原料进行了检测，检测结果见表2。3 批样品中均未检测出AMBC 杂质（<0.021 ppm），说明采用拟定合成和纯化工艺能够有效避免阿齐沙坦原料中AMBC 的残留风险。

表2 阿齐沙坦原料中AMBC的残留量检测结果 ppm

采用该方法，对3 批工艺中间体（步骤6）样品（批号：Y9117-200401，Y9117-200402，Y9117-200403）也进行了检测，结果表明：这些工艺中间体中AMBC 残留水平均低于检测限（<0.021 ppm），进一步验证了候选阿齐沙坦原料采用的合成和纯化工艺能够有效避免残留叠氮化杂质AMBC。

3 讨论

AMBC 杂质属于残留风险较大的工艺副产物，带叠氮化警示结构，残留水平要求非常苛刻，故采用了灵敏度较高的液相-串联质谱技术进行了方法开发。在方法建立阶段，对AMBC 杂质的定量离子和定性离子进行了筛选，并且针对性优化了离子源参数及碰撞电压，优化后的LC-MS/MS 法的最低检测限（0.021 ppm）甚至低于限度要求（37.5 ppm）的千分之一，能够充分满足方法的检测灵敏度要求，而且方法的准确度、线性、专属性、重复性也均很理想，能较好地满足阿齐沙坦原料及其工艺中间体中痕量AMBC 的残留风险评估。另外，需要注意的是：目标杂质AMBC 在溶液状态下，如果在室温条件下进样，稳定性会受到影响；若将进样温度设定在10 ℃，其溶液的稳定性在12 h 之内有保障，故建议各溶液配制后置于冷藏条件下保存。

目前，尚未查询到阿齐沙坦中AMBC 杂质的检测方法报道。本方法的建立将为具有类似警示结构的叠氮类杂质的残留风险监控提供很好的借鉴。

4 结论

本研究采用串联质谱技术，首次建立了能够用于阿齐沙坦原料中带叠氮化合物警示结构的AMBC杂质残留量检测的方法，所建的方法灵敏度高、专属性强、准确度高，在能够覆盖限度水平的较宽浓度范围内呈良好的线性关系，方法的进样精密度、重复性均很理想，能够较好地满足阿齐沙坦原料中痕量AMBC 杂质的残留量检测需求，有效地保障了阿齐沙坦原料及其制剂的用药安全。