秦坤良

(通标标准技术服务有限公司广州分公司，广东 广州 510663)

铁叶酸片是一种复方膳食补充剂，可以同时补充铁和叶酸，其配方由硫酸亚铁、叶酸以及其它赋形剂组成。叶酸为B族维生素的一种，也称维生素B9，在人体内参与氨基酸和核酸的合成，和维生素B12一起共同促进红细胞的生长。叶酸缺乏与巨幼细胞贫血、神经管畸形、唇腭裂等疾病有直接关系。铁为血红蛋白和肌红蛋白重要的组成部分，铁叶酸复方制剂主要用于缺铁性贫血和预防新生儿畸形[1-5]。

对于食品中叶酸检测，目前有GB5009.211-2022《食品安全标准 食品中叶酸的测定》，采用是微生物培养法，适合混合形式的叶酸测定，方法耗时时间长，培养时间需要20～30 h，测试效率低。保健食品中叶酸来源为单一形式，采用高效液相色谱法效率更高，对于单一配方叶酸片这类保健食品，一般都采用《中国药典2020版》二部叶酸片项下含量测定方法进行，药典方法采用0.5%碱性氨水溶液于热水浴中震荡提取20 min，冷却后定容过滤，采用高效液相色谱法分析。但对于含有铁元素的复方叶酸片采用本方法检测，测定结果则比理论值显著偏低。有研究表明亚铁离子在氨水中会形成氢氧化亚铁沉淀，沉淀形成絮状物会吸附包裹叶酸分子，导致叶酸结果降低[6-7]。也有研究认为亚铁离子在溶液中通过氧化还原反应破坏叶酸的结构，从而使叶酸含量降低[8]。

本试验通过在药典的前处理方法基础上增加加入一定量的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)络合剂络合掩蔽亚铁离子从而保护叶酸，提高叶酸测定结果的准确度。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

Agilent 1260高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器，美国Agilent；分析天平，精确到0.01 mg，梅特勒托利多；超声波清洗器，小美超声XM-2200；pH计 ，梅特勒托利多。

1.2 试 剂

甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；磷酸(色谱纯)；氨水(优级纯)；磷酸二氢钾(分析纯)；1 mol/L四丁基氢氧化铵的甲醇溶液(分析纯)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA，分析纯)；叶酸对照品(纯度90.91%)，Dr.Ehrenstorfer；铁叶酸片(某品牌提供)；空白片(除叶酸外其它配方正常存在，某品牌提供)；磷酸盐缓冲液：取2.0 g磷酸二氢钾，加800 mL水溶解，加四丁基氢氧化铵甲醇溶液7.5 mL，加1 mol/L磷酸7 mL，冷却后用磷酸或氨水调节pH值5±0.2，用水定容至1000 mL。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱温箱温度：30 ℃；检测波长：280 nm；流速：1.2 mL/min；进样体积：20 μL；流动相：磷酸盐缓冲液(1.2)∶甲醇=73%∶27%，运行时间20 min。

2.2 对照品储备溶液配制

精密称取叶酸对照品10 mg至10 mL容量瓶中，加0.5%氨水溶解并定容，即得1 000 mg/L的储备液。

2.3 工作曲线配制

分别移取1 000 mg/L的叶酸标准储备液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL至10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，即得浓度为0.5、1、5、10、15、20 mg/L的叶酸工作曲线溶液。

2.4 供试品溶液制备

称取样品1 g，置于100 mL容量瓶中，加入EDTA 0.5 g，加0.5%氨水溶液60 mL，60 ℃超声波提取20 min(每隔5 min振摇一次)，冷却至室温，用水定容至刻度，摇匀，过膜上机。

2.5 空白样品溶液制备

称取空白片样品1 g，按2.4制备空白样品溶液。

2.6 方法专属性考察

取空白样品、空白样品加标按2.4程序制备空白样品溶液和空白样加标溶液，后按2.1色谱条件分析，如图1所示，空白样品在叶酸峰附近无干扰峰存在，说明用上述色谱条件分析，空白辅料中没有对叶酸造成干扰的杂质。另外空白加标样叶酸出峰时间和对照品一致。

图1 空白样品

图2 空白样品加标

图3 叶酸对照品

2.7 线性关系考察

取2.3项下配制的工作曲线溶液，按2.1色谱条件分析，以面积为纵坐标y，溶液浓度mg/L为横坐标x做相关回归，得到曲线方程为y=59.40x+1.166，相关系数r=0.999 97，线性范围为0.5～20 mg/L。

2.8 方法重复性和中间精密度

2.8.1 重复性

由同一人员用同一台设备在相同时间内对同一样品平行测试六次，检测样品含量平均值为0.29 mg/g，RSD为1.3%，数据如表1所示。

表1 重复性试验结果

2.8.2 中间精密度

由不同人员，用不同仪器，在不同时间对同一批样品进行六次平行测定，检测平均值为0.29 mg/g，两组结果RSD 为1.1%，结果见表2。

表2 中间精密度试验结果

2.9 方法回收率考察

依据重复性试验得到的样品含量的平均值0.29 mg/g作为样品理论值，取空白样品分别进行样品含量的低(0.8倍)，中(1倍)，高(1.2倍)三个浓度水平加标，每个水平浓度做三次平行测试，数据如表3所示，结果显示低、中、高三个浓度水平加标回收率范围97.33%～99.73%，RSD范围为0.32%～0.71%。

表3 样品加标回收试验结果

2.10 方法检出限和定量限考察

按曲线最低点0.5 mg/L对空白样品进行加标实验，平行测定20次，检出浓度根据本方法液固比100倍计算到样品中含量，方法检出限为 9 mg/kg，方法定量限为26 mg/kg具体数据见表4。

表4 方法的检出限和定量限

2.11 方法耐用性考察

分别对取样量、超声提取温度、超声提取时间，结果显示不同取样量0.5 g、1.0 g、1.5 g 检测结果平均值为0.3 mg/g，RSD为1.0%；不同超声温度50 ℃、60 ℃、70 ℃之间检测结果平均值为0.3 mg/g，RSD为0.3%；不同提取时间10 min、20 min、30 min之间检测结果平均值为0.3 mg/g，RSD为0.2%，从实验结果说明称样量、提取温度和提取时间细微的变化不会影响检测结果，方法耐用性良好。

2.12 EDTA加入量考察

分别加入不同EDTA量考察检测的叶酸结果，发现EDTA加入量分别为0.1 g、0.5 g、1.0 g、1.5 g检测得到的结果分别为0.20 mg/g、0.29 mg/g、0.28 mg/g和0.29 mg/g。加入量为0.1 g时检测结果偏低，说明加入量偏少不足以络合掩蔽所有的亚铁离子，有部分亚铁离子生成沉淀影响了叶酸结果。当EDTA量增加到0.5～1.5 g时，结果稳定在0.29 mg/kg，说明0.5 g EDTA已经足够络合所有亚铁离子，再提高到1 g或1.5 g，EDTA 都属于过量，过量EDTA 不影响叶酸含量，检测结果基本和0.5 g加入量一致。

2.13 提取液选择

叶酸的结构是由蝶呤、对氨基苯甲酸和一个或多个谷氨酸组成，其结构包含多个羧基，故易溶于碱性溶液。《中国药典》选择用氨水作为提取溶剂，而在GB/T17813-2018 《添加剂预混合饲料中烟酸和叶酸测定》中则采用是pH为9的弱碱性碳酸钠溶液作为提取液，本实验基于药典方法对含铁叶酸片中叶酸的检测优化，故选择和药典方法一致0.5%氨水作为提取剂。

3 结 论

现行药典方法适合单方叶酸片中叶酸含量检测，对于含有复杂矿物元素的复方铁叶酸片，直接采用药典方法，检测效果很差，检测结果远低于理论添加量。主要原因是由于复方中亚铁离子和氢氧化铵溶液作用会产生氢氧化亚铁沉淀，沉淀会吸附或包裹一部分叶酸分子导致不能提取完全，故会直接采用碱溶液提取结果会比实际偏低[6-7]。同时也有研究认为，在碱性溶液下亚铁离子会对叶酸结构产生破坏，导致叶酸含量偏低[8]，故当存在亚铁离子或其他矿物元素时，需要先掩蔽这些离子的干扰，从而可以提高叶酸检测的准确度。

本试验在药典方法的基础上，通过加入络合剂络合掩蔽金属铁离子，再对叶酸进行提取和检测，经验证方法准确度、精密度和重复性均良好。相比药典方法，本方法可以明显消除复方制剂中铁元素对叶酸的干扰，提高叶酸检测准确度，可以作为含铁叶酸复方制剂中叶酸含量检测的参考。