刘周亮,杨超,汪慧君,林志淼

1 临床资料

患儿男,3岁,全身多发皮下结节2年。患者于1岁时全身多处出现肤色皮下结节,且随年龄增长逐渐增多,无明显自觉症状。父母非近亲结婚,家族中无类似疾病患者。患儿足月顺产,其异卵孪生弟弟无类似表现。患者父母否认患者慢性病及传染病史,无药物过敏史。体检:一般情况良好,智力正常,肢体无畸形,系统检查无异常。皮肤科情况:左上臂屈侧、脐左侧、右下腹、左大腿近膝处、左侧臀部、右下肢屈侧可见多发散在皮下结节,呈肤色、形状不规则,直径为0.5～1.0 cm大小不等,略高出皮面,表面光滑,质软,部分融合,无触痛、压痛(图1)。四肢长骨X线检查未见异常。皮损组织病理示:表皮无明显改变,真皮脂肪上移,脂肪间隔胶原增粗,透明变性,纤维母细胞增多(图2a～2b)。弹力纤维染色示:真皮内弹力纤维增生、粗大(图2c～2d)。阿新蓝染色示:黏蛋白沉积于真皮下,多灶(+)(图2e～2f)。

图1a～1b 多发肤色、不规则皮下结节,边界欠清

HE×50;HE×100;EVG×50;EVG×100;Alcan blue×50;Alcan blue×100

经医院伦理委员会同意,患者家属签署知情同意书后,采集患者及其父母外周血各4 mL,采用2%乙二胺四乙酸(EDTA)进行抗凝。使用QIAGEN试剂盒提取基因组DNA,并在使用紫外分光光度计进行定量和纯度检测后,采用全外显子组测序方法对患者血液提取的基因组DNA进行检测,检测到的变异进行注释,过滤掉常见变异(最小等位基因频率>0.01)。使用SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster等软件对变异位点进行致病性预测。对候选基因突变位点进行Sanger测序验证:针对LEMD3基因(NM_014319.5)突变位点所在外显子的上下游设计引物,其中正向引物序列为5′-TGGATTCGTCAACAGGCTCC-3′,反向引物序列为5′-ATGTAAAACGCTAAGCGCGG-3′。DNA扩增后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。PCR产物纯化后送至广州天一辉远生物科技有限公司进行测序。产物测序结果与Ensembl网站(https://asia.ensembl.org/)公布的序列对比,发现患者LEMD3基因1号外显子上存在c.1323C>G (p.Tyr441*)杂合突变(图3a),父母未见相同突变(图3b～3c),提示为新发突变。该突变位点未见于任何正常人群变异频率数据库,包括ExAC及gnomAD等数据库。因此,根据基因测序结果将该病例确诊为Buschke-Ollendorff综合征(BOS)。鉴于该患者孪生弟弟为异卵双生,且无表型,考虑其弟弟与该疾病无相关性,无基因检测的必要性,故未行检测。

图3a 患者LEMD3基因1号外显子发生c.1323C>G(p.Tyr441*)杂合无义突变:图3b～3c 患者父亲、母亲LEMD3基因序列图

2 讨论

Buschke-Ouendorff综合征(BOS)(OMIM 166700),又名布席克-奥伦道夫综合征、播散性豆状皮肤纤维瘤,是一种罕见的、良性的常染色体显性遗传的疾病,发病率约0.005%[1],其典型特征为出现结缔组织痣、脆弱性骨硬化[2]。两者可同时出现,也可单一出现。结缔组织痣是由真皮细胞外基质成分如胶原纤维、弹性纤维或黏多糖等构成的错构瘤,可根据病变的组成成分分为:①胶原型;②弹力蛋白型;③黏蛋白型。本例属于混合型。此外,结缔组织痣可根据是否伴发其他病变分为:①不伴其他器官病变型;②伴发结节性硬化症;③伴有脆弱性骨硬化。脆弱性骨硬化是一种骨骼发育不良,其特征是X光检查下,骨内具有弥漫性的斑点状致密骨质,也被称为骨斑点症[3]。

2004年,LEMD3基因的功能缺失性突变被证实是导致BOS发病的遗传学病因[4]。LEMD3也被称作MAN1,位于染色体12q14.3,编码内核膜蛋白,内核膜蛋白通过与Smad家族蛋白质相互作用,可拮抗TGF-β和BMP信号通路。LEMD3表达的缺失导致成纤维细胞中的TGF-β和BMP信号通路异常上调,促使结缔组织和弹性蛋白的形成,从而产生特异性的临床表型。

目前BOS的诊断主要基于临床表现、影像学表现、组织病理学、遗传分析。由于该疾病具有明显的临床异质性,不同患者可出现差异明显的临床表现。因此更需要遗传分析确诊[1]。本例皮损表现为全身多发皮下结节,结合病史、组织病理检查,临床诊断为结缔组织痣。结合基因检测结果,依据ACMG(http://www.acmg.net)指南标准,该变异被判断为致病变异,因此可将该病例最终确诊为BOS综合征。c.1323C>G无义突变目前尚未见报道,但既往曾有学者报道c.1323C>A突变的BOS病例[1,4],该突变与笔者发现的突变具有相似的致病机制。该位点可导致翻译水平提前出现终止密码子,引起LEMD3蛋白表达减少,可能导致该病的发生。本例患者无自觉症状,皮损随年龄增长而增多,除皮肤以外未发现其他系统性病变,因而未进行治疗。值得注意的是该患者目前暂未出现骨损害。结合以往报道,BOS患者可出现脆弱性骨硬化、肢骨纹状肥大等骨损害。脆弱性骨硬化往往较晚出现,一般是在10岁以后出现[5]。肢骨纹状肥大,是一种较脆弱性骨硬化更加严重的骨损害,是由于间充质发育不良伴增生,骨皮质增宽所引起[1,6]。该症状会在X线上呈“滴蜡样”改变,可导致骨骺提前闭合,引起肢体不等长、活动受限等,需要早期干预,必要时进行手术治疗。因此笔者建议患者定期进行四肢骨骼X线检查,定期随访。

LEMD3基因全长约78 kb,包含13个外显子。查阅开放数据库LOVD(http://databases.lovd.nl/whole_genome/genes/LEMD3),已知至今检测出125个LEMD3基因的致病性突变,包括113个点突变、9个缺失突变、2个插入突变和1个重复突变。本研究发现1例新发LEMD3无义突变c.1323C>G(p.Tyr441*),最终导致BOS,丰富了LEMD3基因突变库,为BOS的遗传咨询和产前诊断提供了理论依据。