王铭 夏鑫 游旅 韦德琴 刘艳敏 刘英 韦小瑜

李斯特菌（Listeria）是一类革兰阳性无芽孢无荚膜的短小杆菌，为人畜共患病病原菌[1]。大多数李斯特菌引起的感染是食源性的，牛奶、乳制品、肉类、蔬菜、沙拉、海产品和熟食是常见的感染源[2]。临床表现为胃肠炎、脑膜炎、败血症、单核细胞增多和流产等症状[3]。主要感染者为免疫力低下的人群、孕妇和新生儿，食源性的李斯特菌发病率虽然不高，但死亡率可高达 20%～30%[4]。在欧洲和美国等发达国家，由单增李斯特菌感染引起的暴发或散发李斯特菌病均有报道[5]。我国 2011—2016 年共报道了19 个省的253 个李斯特菌病例，病死率为25.7%[6]。而贵州省近几年关于李斯特菌病的相关研究较少。李斯特菌血清型分型是通过多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），将其分为5 个血清组[7]。脉冲场凝胶电泳（pulse-field gel electrophoresis，PFGE）一直被广泛用于李斯特菌的分子分型中，是李斯特菌病暴发溯源调查的“金标准”[8]。目前贵州省关于李斯特菌血清型和PFGE 分子分型相关研究较少。本研究对贵州省遵义市收集的242 份食品标本进行鉴定，分离出5 株李斯特菌进行 PCR 鉴定，血清型分型和 PFGE 分子分型，为贵州省李斯特菌病防控提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

来自2021 年贵州省致病菌识别网遵义市网络实验室监测的食品样本，样品采集按照贵州省致病菌识别网监测方案要求，以肉类、海鲜、乳制品、米面制品和凉拌菜为主。PFGE 参考菌株沙门菌 H9812 标准株来自国家致病菌识别网中心实验室[9]。

1.2 主要试剂和仪器

单增显色培养基（法国 CHROMager 公司）、营养琼脂平板（环凯生物有限公司）、 DNA 提取试剂盒、溶菌酶（西安天隆）； 2×Taq PCR MasterMix （含染料）（北京Tiangen）；蛋白酶 K、Xba Ⅰ（日本 TaKaRa）；限制性内切酶 Asc Ⅰ （New England Bio-labs）。全自动核酸提取仪（西安天隆）；PCR 仪（美国 Thermo Fisher Scientific）；脉冲场凝胶电泳仪及配套设备、全自动凝胶成像仪、电泳仪（美国 Bio-Rad）。所有培养基和试剂均在有效期内使用。

1.3 方法

1.3.1 标本的分离培养及初步鉴定

按照贵州省致病菌识别网监测方案要求，同时根据《食品安全国家标准食品微生物学检验》（GB 4789—2016）的执行标准。225 mL LB1 增菌培养液中加入食品样本25 g（mL），30 ℃培养 24 h，在10 mL LB2 增菌培养液中加入0.1 mL LB1 增菌培养液，30 ℃培养 24 h，将LB2增菌培养物接种于单增李斯特显色平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落特征，用无菌接种环挑取典型菌落在营养琼脂平板上进行三区划线，37 ℃培养24 h。用无菌生理盐水将营养琼脂平板生长的典型菌落制成菌悬液，采用质谱微生物鉴定仪进行初步鉴定。同时用菌悬液进行革兰染色镜检观察结果。将初筛分离菌株保存至磁珠冻存管并送至贵州省致病菌识别网中心实验室进行下一步实验。

1.3.2 模板的制备

取-80 ℃磁珠冻存管保存的李斯特菌，用李斯特菌显色培养基复苏培养，37 ℃培养24 h。挑取蓝色有白色晕圈的菌落三区划线接种于营养琼脂平板，37 ℃纯化培养24 h。用无菌拭子蘸取营养琼脂平板上部分纯菌，按照西安天隆科技细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书，制成菌悬液，提取5 株李斯特菌总DNA，将DNA 模板放于-20 ℃冻存备用。

1.3.3 菌株 PC 鉴定

通过PCR 扩增李斯特菌属特异基因prs 和单增李斯特菌特异基因lmo2234 对菌株进行鉴定，由北京天一辉远生物公司合成相关引物，相关引物序列及产物长度见参考文献[10]。采用1.5%琼脂糖对 5μL PCR 扩增产物进行凝胶电泳，Marker 采用DL1000，使用凝胶成像仪观察电泳结果。

1.3.4 血清型分型

采用多重PCR 方法，扩增李斯特菌的特异性基因lmo0737、lmo118、ORF2819、ORF2110 和 prs，对李斯特菌进行血清分型，由北京天一辉远生物公司合成相关引物，其序列及产物长度[11]见表1。采用1.5%琼脂糖对5 μL PCR 扩增产物进行凝胶电泳，DL2000 作为 Marker，采用凝胶成像仪观察电泳结果。

表1 单增李斯特菌血清型分组引物序列

表2 5 株李斯特菌样本信息

1.3.5 PFGE 分型

参照《国家致病菌识别网技术手册》中李斯特菌PFGE操作程序，对5 株李斯特菌进行PFGE 分子分型，以沙门菌 H9812 作为标准菌株[10]，采用限制性内切酶 Asc Ⅰ和 XabⅠ酶切，37 ℃ 4 h 后进行电泳，电泳初始转化时间：4 s；终末转化时间 40 s ；电泳时间 18 h。经凝胶成像系统获得 tif格式图片，应用 BioNumerics 8.0 软件对获得的 PFGE 电泳图谱进行聚类分析。

2 结果

2.1 菌株分离鉴定结果

2021 年贵州省致病菌识别网遵义市网络实验室共采集242 份食品监测标本，成功分离出63 株菌株，根据质谱结果显示，其中5 株为李斯特菌（湄潭县2 例、汇川区1 例、红花岗区1 例和正安县1 例）分离率为2.07%（5/242），李斯特菌占比为7.94%（5/63）。5 株李斯特菌详细菌株样本信息见表 2。

2.2 PCR 鉴定结果

经37℃ 24 h 培养，5 株分离株在李斯特菌显色培养基上出现特异性蓝色菌落，周围有白色晕环，镜检结果为革兰阳性小杆菌（图1）。PCR 扩增结果显示，5 株分离株均扩增出李斯特菌特异基因prs，结果为阳性，分离株 GZ-ZY2021-134、GZ-ZY2021-063、GZZY2021-035 和GZ-ZY2021-006 在 420 bp 处出现DNA条带，扩增出单增李斯特菌特异性基因lmo2234，即该4 株分离株为单增李斯特菌，而分离株GZ-ZY2020-111为李斯特菌，见图2。

图1 显色培养基培养情况及革兰染色结果（×100）

图2 5 株李斯特菌PCR 鉴定结果

2.3 血清型分型结果

利用多重PCR 方法扩增李斯特菌的特异性基因lmo0737、lmo118、ORF2819、ORF2110 和 prs，进行血清分型，PCR 扩增结果显示，分离株 GZ-ZY2021-006、GZ-ZY2021-063 和 GZZY2021-035 菌株在Lmo0733 特异性基因691 bp 处有扩增条带，为1/2 a、3a 血清型，属于家系Ⅱ；分离株GZ-ZY2021-134 在ORF2110 特异性基因579 bp 处有扩增条带，为 4b、4d、4e 血清型，属于家系Ⅰ。而分离株 GZ-ZY2020-111 结果为阴性，未检测出其对应的血清型（图3）。

图3 5 株李斯特菌多重PCR 血清型检测结果

2.4 PFGE 分型结果

采用BioNumerics 8.0 软件对5 株分离株的PFGE 电泳图谱进行聚类分析，结果显示经限制性内切酶 Asc Ⅰ酶切获得5 种PFGE 带型，相似性为 45%～85% 。其中分离株 GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-006 相似性为85%，分离株GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-035 相似性为77%，3 株李斯特菌血清型均为1/2 a、3a 血清型。而分离株GZ-ZY2021-134 血清型为4b、4d、4e，与分离株GZZY2021-006 和 GZ-ZY2020-111 相似性低于70%，见图4。

图4 5 株李斯特菌PFGE 分型结果

3 讨论

李斯特菌是一种食源性人畜共患病原菌，人和动物一般通过摄入污染该菌的食物继而感染李斯特菌病[12]。李斯特菌属目前包括17 个李斯特菌种：6 个常见种和11 个新发现的种，其中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌为致病性李斯特菌[13]。单增李斯特菌是导致人和动物李斯特菌病的主要病原体，而伊氏李斯特菌主要引发在啮齿类动物[2]。在很多发达国家，由李斯特菌污染的食品而导致的患病率及死亡人数不断上升，大量暴发事件备受关注。尤其以即食食品最为常见，包括即食熟肉、凉拌蔬菜、奶制品和水果等。有研究表明，2012—2014 年我国14 个省份，24 个城市的1 036 份蔬菜、生肉、乳制品等零售食物样本，共分离到248 株单增李斯特菌[14]。本研究对242 份食品监测标本进行分离培养鉴定，分离出的5 株李斯特菌主要来源于肉类、乳制品和米面制品，分离率为 2.07%，与全国主要污染食品一致，但分离率低于我国 2012—2014 年李斯特菌分离率。贵州省李斯特菌分离率较低可能与各地区饮食习惯不同以及检测标本较少有关。来自遵义市正安县分离株GZ-ZY2020-111 为乳制品，经PCR 鉴定非单增李斯特菌种属，而其血清型分型失败，提示贵州省可能出现李斯特菌其他种属，需进一步结合毒力基因检测和全基因组测序结果共同进行进一步分析。

李斯特菌可分为13 种血清型，4 个家系[2]，根据流行病学资料发现，95%的李斯特菌病由血清型 1/2a、1/2b、4b菌株引起[15]。家系Ⅰ菌株多引起李斯特菌病的暴发和散发，主要包括血清型 1/2b 和 4b 菌株；家系Ⅱ菌株与食品及食品加工环境污染相关，主要包括1/2a 和 1/2c；家系Ⅲ和Ⅳ菌株较为罕见，主要和动物致病相关。本研究通过多重 PCR 法对遵义市5 株分离株进行血清型分型，获得的李斯特菌优势血清型主要为 1/2a、3a 血清型，其次是4b、4d、4e 血清型。其结果与北京市、重庆市等国内的研究报道李斯特菌污染食品检出的优势血清型为4b、1/2a 和1/2b 结果一致[16]，提示贵州省李斯特菌主要以食品污染为主，有人间感染的可能性。

PFGE 是基于细菌的 DNA 特征进行分析通过电泳条带比对菌株亲缘关系，对于细菌的溯源，协助传染病监测、追踪感染来源及识别暴发具有重要的意义[2]。为了进一步了解贵州省遵义市分离的李斯特菌分子流行病学特征，本研究采用PFGE 分型方法将5 株李斯特菌分为5 种PFGE 带型，相似性为45%～85%。结合血清型分型结果显示，分离株 GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-006 相似性为85%，分别来自遵义市湄潭县和遵义市红花岗区，分离的食品来源分别为肉类制品和米面制品；而分离株GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-035 相似性为77%，均来自遵义市湄潭县且均分离自肉类制品，该两株分离株血清型均为1/2 a、3a 血清型，提示湄潭县肉类食品可能存在食品污染情况。

综上所述，2021 年贵州省遵义市食品环境中具有多种类型的李斯特菌，且可能随着地区间食品运输和销售链等途径进行扩散传播，但并未形成流行或聚集性病例，而是高度散发。由于本研究涉及的样本数量较少，因贵州省2021 年尚无人间感染病例，监测地区较为单一，结果是否具有代表性，还需要扩大监测样本数量，加强人间病例监测，扩大监测地区，通过全基因组测序方法、毒力基因检测和耐药基因研究进行进一步分析，以提供更全面的李斯特菌实验室监测数据。