杨志晓 侯骞 刘国权 卢志刚 曹毅 芶剑渝 王轶 林英超

（1.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；2.西北农林科技大学农学院，杨凌 712100；3.贵州省烟草公司铜仁市公司，铜仁 554300；4.贵州省烟草公司遵义市公司，遵义 563000）

烟草赤星病是由链格孢菌（Alternaria alternata（Fries）Keissler）侵染烟株引起的一类真菌性病害，属于中国烟叶生产中的主要病害之一［1］。该病具有潜育期短、流行速度快的特点，在外界环境条件适宜情况下，短时间内就能够大面积爆发流行。烟草赤星病主要危害叶片，严重时还会影响茎秆、花梗与蒴果，造成产量、品质降低，不利于优质烟叶生产，但迄今尚无十分有效的防治途径［2-3］。因此，深入研究烟草赤星病的致病机理，培育抗性良好的优质品种是目前烟叶生产中亟待解决的问题。

光合作用为植物生长发育提供所必需的物质和能量，是决定产量、品质的最关键因素［4］。大量研究证实，病原菌侵染能够作用于寄主光合活动，最终改变光合作用进程［5-6］。因此，病原菌如何影响植株的生理活性进而抑制光合作用始终是植物-病原菌互作研究的重点。光合作用对外界环境变化十分敏感［7］。影响光合作用的各种外界逆境胁迫因子均通过影响叶绿体中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）而发挥作用，但Rubisco必须经过核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶（RCA）的活化方能显现出其羧化/加氧活性，即Rubisco在植株中的活性高低取决于RCA对它的活化［8］。在外界逆境胁迫条件下，植物光合作用的变化与Rubisco、RCA活性具有密切关系［9-10］。在盐胁迫下，四倍体金银花叶片的Rubisco活化状态与气孔导度均处在较高水平，有助于保持较强的光合性能［11］。低产玉米具有较低的RCA活性，而提高RCA水平则有助于增加Rubisco活性和光合活动速率，并伴随着玉米产量的上升［12］。干旱、高温和二者复合胁迫均可降低Rubisco、RCA活性，进而造成小麦叶片的叶绿素含量与光合速率出现明显下降［13］。与此同时，Rubisco、RCA的基因表达水平也显著影响植物对外界胁迫的适应能力［14］。莴苣光合效率下降是由于Rubisco大亚基基因（rbcL）、小亚基基因（rbcS1、rbcS2）和RCA基因（rca1、rca2）表达量的降低所造成的［15］。弱光胁迫可抑制Rubisco大、小亚基（rbcL、rbcS）与RCA（rca）的mRNA表达，引起Rubisco活性降低，最终导致黄瓜光合作用下降［16］。在中度水分亏缺处理下，外源NO能提高玉米叶片的Rubisco、RCA活性及基因（rbcL、rbcS和rcaβ）表达水平，从而有助于增加Rubisco羧化效率［17］。

在赤星病发生后，烟草叶片出现病斑而褪绿变黄，严重时病斑融合成碎叶或枯焦叶，造成光合器官受损，显示出赤星病对烟草叶片的危害和光合作用密切相关［18-20］。现阶段关于烟草赤星病的研究大部分集中在赤星病菌生理小种的分化和遗传多样性［21］、病害主要发生规律［22］与防治途径［23］，以及不同种质资源抗病能力的综合评价［24］等方面，而关于赤星病胁迫对烟草光合特性的影响及其作用机理的研究报道则相对较少。因此，深入探讨赤星病胁迫下Rubisco、RCA变化对光合作用的调控具有重要意义。基于此，本研究以不同抗性烟草品系为对象，系统分析赤星病胁迫对Rubisco、RCA活性及其基因表达的影响，旨在进一步阐明赤星病胁迫抑制烟草光合特性的相关生理机制，从而为抗病品种选育和病害防治提供有益借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

所用烟草（Nicotiana tabacum L.）材料分别为抗、感赤星病品系JYH、CBH（JYH是由CBH的抗赤星病突变单株经系统选育而成）［25］。试验采用漂浮育苗方式进行育苗，于6叶1心时选择生长整齐一致的壮苗移栽到盛有20 kg土的聚乙烯塑料盆（高27 cm×外径33 cm×内径21 cm）内，每盆种烟一株，每个品系共计种植150盆。供试土壤属于壤质潮土（有机质8.53 g/kg、全氮0.92 g/kg、速效氮65.47 mg/kg、速效磷24.55 mg/kg、速效钾108.16 mg/kg、pH 7.92）。每盆烟株N、P2O5、K2O的施用量是0.13、0.13和0.39 g/kg，肥料分3次施入，施入时间分别在移栽当天、移栽后第1周及第2周，肥量比例2∶1∶1。

以致病力较强的烟草赤星病菌（Alternaria alternata（Fries）Keissler）GM831为供试菌株。在25℃环境下，将供试菌株在PDA平板上连续培养7 d。在充分产孢后，置于10 mL 1%（体积质量分数）无菌葡萄糖溶液中浸泡15 min，采用无菌棉签洗下孢子与菌丝体，经过4层无菌纱布过滤后除去菌丝体，此后用1%无菌葡萄糖溶液配成孢子悬浮液（浓度为1.0×105个/mL）用于开展赤星病菌人工接种［26］。

移栽后50 d时，选择烟株第3、4叶位叶片（从下向上数，下同），使用孢子悬浮液喷雾法进行人工接种（赤星病菌孢子悬浮液在人工接种时现用现配）。用小型手持喷雾器将孢子悬浮液喷洒到烟草叶片上，叶面达到均匀布满孢子悬浮液但不下淌的程度，以1%无菌葡萄糖溶液处理作为对照［27］。接种后将烟株置于人工气候室中于25℃黑暗保湿24 h，此后进行正常管理，保持昼/夜温度为26℃/20℃，相对湿度达到65%。于接种赤星病菌后的第5、9天的上午9:00-11:00 选择接种叶片进行光合作用测定，然后进行取样。在去除主、侧脉后，把叶片剪碎混匀用液氮速冻后保存在-80℃超低温冰箱内，用于各项指标的测定。每个指标测定重复3次。

1.2 方法

1.2.1 光合作用参数 使用Li-6400便携式光合仪（Li-Cor Inc.，USA）分别测定净光合速率［Pn, μmol CO2/（m2·s）］、气孔导度［Gs, mmol/（m2·s）］、胞间CO2浓度（Ci, μmol/mol）［27］。测定时使用红蓝光源叶室，采用开放式气路，叶室温度达到25℃，空气相对湿度为60%-70%，CO2浓度是400 μmol/mol，光照强度达到1 000 μmol/（m2·s），光量子通量密度是800 mol/（m2·s）。

1.2.2 Rubisco、RCA活性 取烟草叶片0.1 g，置于研钵内分别加入液氮、1%不溶性PVP和1.9 mL预冷提取液［HEPES-KOH（pH 7.0）50 mmol/L，EDTA 1 mmol/L，MgCl25 mmol/L，ATP 0.4 mmol/L，DTT 15 mmol/L，PMSF 1 mmol/L，Benzamidine 2 mmol/L，Leupeptin 0.01 mmol/L］磨成均浆，此后15 000×g离心10 min［28］，所得的上清液使用植物酶联免疫分析试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司生产）用于测定Rubisco、RCA活性。

1.2.3 Rubisco、RCA基因相对表达量测定 将烟草叶片10 g在研钵中用液氮研磨至发白粉末状，此后使用RNAiso Plus试剂盒进行RNA提取。cDNA第一链的合成采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒开展，Real-Time PCR使用SYBRRPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）试剂盒，均由上海宝生物工程有限公司生产。根据GenBank和烟草基因组数据库的核苷酸序列，利用DNAMAN与Primer Premier 5.0软件设计Rubisco大亚基基因（rbcL）、小亚基基因（rbcS）以及RCA基因（rca）引物序列，以Actin作为内参基因（表1），依据2-ΔΔCT法计算各个基因的相对表达量［29］。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time quantitative RCR

1.2.4 Rubisco、RCA蛋白含量 Rubisco蛋白rbcL、rbcS及RCA蛋白rca含量根据间接Elisa法进行测定［30］。

1.2.5 数据分析 利用SPSS 19.0软件对数据开展统计分析, 并使用Sigma Plot 10.0软件进行作图。

2 结果

2.1 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系光合特性的影响

如图1所示，赤星病胁迫引起CBH的Pn、Gs连续降低，而Ci却呈增加趋势，且与对照间的差异均达到显著水平（P＜0.05）。在胁迫9 d时，CBH的Pn、Gs较对照分别下降62.28%、66.67%，而Ci为对照的1.57倍。胁迫5 d时，JYH的Pn、Gs、Ci和对照间均无显著差异，此后JYH的Pn、Gs和Ci呈现明显下降，降幅分别达到39.24%、35.42%及30.74%。赤星病胁迫9 d，JYH的Pn、Gs分别为CBH的1.59、1.82倍，而CBH的Ci则是JYH的2.30倍，差异均达到显著水平（P＜0.05）。

图1 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系光合作用参数的影响Fig.1 Effects of brown spot stress on photosynthetic parameters in different resistant tobacco cultivars

2.2 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系Rubisco、RCA活性的影响

与对照相比，CBH的Rubisco、RCA活性在赤星病胁迫下大幅降低，且呈显著差异（P＜0.05）（图2）。在胁迫9 d时，CBH的Rubisco活化状态、初始活性、总活性和RCA活性较对照分别下降72.12%、84.79%、79.84%及86.67%。

图2 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系Rubisco、RCA活性的影响Fig.2 Effects of brown spot stress on the activities of Rubisco and RCA in different resistant tobacco cultivars

在赤星病胁迫5 d，JYH的Rubisco活化状态、初始活性、总活性以及RCA活性均与对照不存在显著差异，此后，Rubisco、RCA活性出现降低。在胁迫9 d时，JYH的Rubisco活化状态、初始活性、总活性与RCA活性分别是CBH的3.79、5.23、3.32和4.44倍，差异达到显著水平（P＜0.05）。

2.3 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系Rubisco、RCA基因表达水平的影响

从图3可以看出，正常生长下，两个品系的Rubisco、RCA基因表达水平无显著差异。在赤星病胁迫下，CBH的rbcL、rbcS、rca相对表达量持续下降，与对照间的差异达到显著水平（P＜0.05）。胁迫9 d时，CBH的rbcL、rbcS、rca表达量分别比对照降低82.84%、70.97%及74.77%。

图3 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系rbcL、rbcS和rca相对表达量的影响Fig.3 Effects of brown spot stress on the relative expressions of rbcL, rbcS and rca in different resistant tobacco cultivars

与对照相比，JYH的Rubisco和RCA基因表达量在胁迫5 d时无明显变化，此后呈增加趋势，且与对照间存在显著差异（P＜0.05）。在赤星病胁迫下，JYH的Rubisco、RCA基因表达水平均显著高于CBH（P＜0.05），胁迫9 d时，JYH的rbcL、rbcS、rca表达量分别是CBH的7.48、4.69、5.82倍。

2.4 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系Rubisco、RCA蛋白含量的影响

在赤星病胁迫下，CBH的rbcL、rbcS和rca含量明显下降，胁迫9 d时，分别比对照低73.56%、84.74%、59.84%，均呈显著差异（P＜0.05）（图4）。JYH的rbcL、rbcS、rca含量在胁迫5 d时与对照间不存在显著差异，然后上升，且显著高于对照（P＜0.05）。在赤星病胁迫9 d时，JYH的rbcL、rbcS和rca含量分别是CBH的6.51、9.23、4.52倍，差异均达到显著水平（P＜0.05）。

图4 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系rbcL、rbcS和rca含量的影响Fig.4 Effects of brown spot stress on the contents of rbcL,rbcS and rca in different resistant tobacco cultivars

2.5 不同抗性烟草品系Pn和Rubisco、RCA基因表达特性的相关性分析

相关性分析结果显示（表2），在转录水平方面，Pn和rbcL、rbcS及rca相对表达量都具有极显著正相关性（P＜0.01）。而在翻译水平上，Pn与rbcL、rbcS、rca含量均无相关性。在翻译后水平方面，Pn和Rubisco活化状态、初始活性、总活性以及RCA活性存在显著正相关性（P＜0.05）。与此同时，rca相对表达量与Rubisco初始活性及总活性存在显著正相关性（P＜0.05），rbcL含量与rbcS含量具有显著正相关性（P＜0.05），而rca含量和Rubisco活化状态、初始活性、总活性则均呈极显著正相关（P＜0.01）。

表2 不同抗性烟草品系净光合速率与Rubisco、RCA基因表达特性的相关性分析Table 2 Correlation analysis betweennet photosynthetic rate andgene expression characteristics of Rubisco andRCA in different resistant tobaccocultivars under brownspot stress

3 讨论

3.1 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系光合作用的影响

光合作用是植株生长生产、质量形成的生理基础，主要包括光能的捕获与转化、电子传递、水光解、碳同化、光合磷酸化及同化物的转化和运输等一系列代谢过程［31］。Balachandran等［32］指出，病原菌侵染导致植物光合速率出现下降。前人研究证实，外界逆境胁迫抑制植物光合作用的原因主要分为气孔限制、非气孔限制两种［33］。当Gs、Ci同时降低时，导致Pn减弱的主要原因是气孔限制因素；在Gs下降但Ci却出现增加时，则显示出非气孔限制因素引起Pn降低［34］。在本研究，胁迫5 d时，抗病品系JYH的光合作用参数包括Pn、Gs、Ci与对照间都不存在显著差异，显示出此时光合作用未受到赤星病胁迫的不良影响，表现出较强的抗病性。而JYH的Pn、Gs及Ci在胁迫9 d均显著降低，说明该阶段的光合作用出现下降是由赤星病胁迫引起的气孔限制因素造成的。这可能是因为赤星病菌能够降低JYH叶片的Gs进而导致CO2吸收量不足所致。与抗病品系JYH表现相反，赤星病胁迫使感病品系CBH的Pn、Gs显著下降，但Ci却呈上升趋势，说明非气孔限制因素明显减弱光合作用，也即CBH叶肉细胞的光合能力受到抑制而造成CO2大量积累在细胞间隙内［35］。这是由于赤星病胁迫对CBH叶片产生严重伤害，造成光合器官受损，使来自外界的CO2经过叶片间隙直接转运到内部，引起光能吸收量大幅减少，从而最终表现为光合作用的显著降低。

3.2 赤星病胁迫对不同抗性烟草品系Rubisco、RCA的影响

Rubisco在卡尔文循环中对植株所吸收的CO2进行固定、同化，其活性高低决定光合暗反应中CO2同化能力，对植物光合作用效率发挥至关重要的作用［36］。RCA属于一类由核基因组编码的叶绿体蛋白，在ATP作用下，使Rubisco迅速和生理浓度的CO2（10 μmol/L）、Mg2+结合生成Rubisco-CO2-Mg2+三元复合物（ECM），从而达到最大活化程度［37］。RCA作为Rubisco的分子伴侣，主要承担促进及稳定Rubisco催化活性的功能［38］。研究证实，芜菁花叶病毒（TuMV）侵染可降低青菜的Rubisco、RCA含量，最终对光合作用造成不利影响［39］。本文研究表明，烟草赤星病对不同抗性烟草品系的Rubisco、RCA活性产生不同程度的抑制作用。与感病品系CBH相比，抗病品系JYH的Rubisco、RCA活性在胁迫前期均未出现明显变化，此后降幅较小，显示出JYH具有较高的CO2同化效率与光合电子传递效率，并且还能够维持光反应同化力（NADPH、ATP）的积累，从而减轻赤星病胁迫的不利影响。作为植物光合作用中固定CO2的一种关键酶，Rubisco活性降低是引起光合速率下降的非气孔限制因素之一［40］。在本文中，JYH、CBH的Rubisco活化状态、初始活性、总活性及RCA活性对烟草赤星病胁迫的响应差异和Pn变化存在较强的一致性，充分表明赤星病胁迫对感病品系CBH的Rubisco、RCA活性造成严重影响，使CO2羧化能力减弱，导致Pn出现下降，最终表现为非气孔限制因素显著抑制光合作用［41］。这可能和赤星病胁迫造成CBH光合磷酸化受阻及ATP供应量不足有关［42-43］。

植物对外界环境的适应性主要通过调节自身基因表达而实现［44］。Rubisco、RCA活性及基因表达对光合作用均具有重要作用［45］。Rubisco大亚基基因rbcL、小亚基基因rbcS转录水平降低引起Rubisco活性大幅下降，最终使2个反义转酮醇酶基因（CsTK）黄瓜幼苗的Pn明显小于野生型［46］。RCA尤其是RCA大亚基基因RCAL也在调控逆境胁迫下水稻光合作用的适应性中发挥重要作用［47］。本文研究结果显示，抗病品系JYH的rbcL、rbcS、rca相对表达量在赤星病胁迫5-9 d均呈上升趋势，表现为Rubisco、RCA蛋白含量增加，使RuBP对CO2的固定量得以提升，从而有利于保持较高的Rubisco羧化效率［48］。这表明JYH能够通过调控Rubisco、RCA基因表达，以缓解烟草赤星病对光合特性的不利影响。而赤星病胁迫引起感病品系CBH的rbcL、rbcS以及rca表达量出现大幅下降，从而抑制Rubisco、RCA基因表达及蛋白合成，使Rubisco、RCA活性降低，最终造成叶片光合功能下降。需要指出的是，本文仅对2个抗、感烟草赤星病品系JYH、CBH的光合作用及Rubisco、RCA活性、基因表达水平和蛋白含量在赤星病胁迫下的变化进行了研究，由于不同烟草品种（系）的赤星病抗性差异较大，因此本研究所用材料的研究结论不一定具有普适性。

4 结论

在赤星病胁迫下，感病品系CBH的Pn以及Rubisco、RCA活性与基因相对表达量均显著下降，表明烟草赤星病对CBH光合作用的抑制效应超出光合机构的适应能力，造成光合功能持续减弱；而抗病品系JYH能够保持较高的Rubisco、RCA活性、基因表达水平及蛋白含量，其抗赤星病能力较强在很大程度上是由于具有较高的Pn及Rubisco、RCA活性。