徐发迪 徐康 孙东明 李萌蕾 赵建志，2 鲍晓明

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院 生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，济南 250353；2.山东大学生命科学学院微生物技术国家重点实验室（微生物技术研究院），青岛 266237）

全球农林生物质弃物储量巨大，以此为原料通过微生物转化生产乙醇，并实现替代部分车用汽油的目的，由于乙醇汽油的特性，使其成为近30年来新型能源研发的重要内容［1］。根据生产原料的类型区分，燃料乙醇生产技术的发展主要经历了以糖质和粮食作物为原料的一代燃料乙醇，以农林废弃植物纤维为原料的二代燃料乙醇和以藻类等绿色植物为原料的三代燃料乙醇［2］。由于日益严重的世界粮食危机问题，我国政府已限制了一代燃料乙醇的发展规模，第三代燃料乙醇正处于研发起步阶段［3］。而具备产业化示范的第二代燃料乙醇生产技术，对于保护粮食安全和缓解能源危机具有巨大的意义。二代燃料乙醇的原料种类丰富，农作物秸秆、枯草、林木枝桠等储量巨大的农林弃物均可利用［4-12］，可保证生物乙醇的可持续发展。现阶段研究应用多集中于秸秆类生物质，而对杨木生物质的二代燃料乙醇技术研究相对较少。

杨木（Populas.sp）属于硬木，纤维结构相对疏松，是生长最快的乔木之一。作为速生丰产树种，在全世界被广泛种植。而随着现代育种技术的发展，使杨木品种更加适应全球不同地区的环境，而且优化了杨木在工业中的应用特性［13］。中国处于世界的杨木种植中心，如今在全国各地分布已超600万hm2，杨树人工林面积居世界之首。同时杨树植伐周期短，应用广泛，每年产生大量的枝桠材和加工业弃料，是能够支撑二代燃料乙醇稳定生产的理想原料之一。燃料乙醇的基本生产工艺主要包括降低原料粒度、破坏纤维素内在结构的理化因子的预处理、释放单糖的酶解糖化、产生乙醇的微生物发酵、乙醇脱水的蒸馏工艺等步骤［14］。木质纤维素是由纤维素（cellulose）、半纤维素（hemicellulose）和木质素（lignin）三大基本组分构成。预处理的目的是破坏纤维素内在结构，提高木质纤维素底物的可及度。酶解糖化过程是将原料中保留的纤维素和半纤维素降解成可发酵性单糖，利用高固底物酶解技术，获得工业化生产中所需要的高糖浓度水解液。发酵反应是以可发酵性单糖（葡萄糖、木糖）为底物，在发酵微生物的代谢作用下高效利用底物转化生产乙醇。而由于原料的不同，每个具体工艺环节上也存在着不同的技术差异和困难［15］，为了克服这些困难，精准构建不同原料的二代燃料乙醇生产工艺是当前的主攻方向。本文综述了以杨木为原料的二代燃料乙醇预处理、酶解和发酵的研究现状及所面临的困难。

1 杨木的组成特点

植物的主要生化成分是木质纤维素，由纤维素、半纤维素和木质素组成，在植物细胞壁内形成复合体，对植物起保护作用［16］；还有来自细胞质内部的非结构性生物化学成分，无机元素等。杨木生物质具有较高的纤维素含量，适中的半纤维素含量，灰分、淀粉和提取物等含量较低，这些特性使它成为生产燃料乙醇的理想原料之一［17］。表1显示了不同木质纤维素原料三大组分的比例差异，而且不同原料在具体结构上也具有不同的组成特点。

表1 不同木质纤维素原料组成成分含量Table 1 Contents of different lignocellulose raw material components

1.1 纤维素

纤维素是一种通过β-1,4糖苷键连接吡喃葡萄糖，以平行束排列的线性聚合物，其分支较少，分子内和分子间的氢键稳定，不容易裂解释放出单糖。即便如此，长期以来科研人员为利用纤维素，开展了大量的研究工作，利用预处理配合纤维素酶解工艺能够有效提高纤维素的解聚糖化效率，为木质纤维素的工业化应用铺垫了道路［21］。而且对比草本类和秸秆类原料，杨木中纤维素含量占比较高，达到干物质量的40%以上。较高的纤维素含量意味着能够提供更多的葡萄糖，从而使相同质量的杨木原料比其他木质纤维素原料在水解后能够提供更高的葡萄糖浓度。

1.2 半纤维素

半纤维素是一种由戊糖（木糖、阿拉伯糖）和己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）组成的异质聚合物，结合在纤维素微纤维的表面以氢键相互连接，在纤维素葡聚糖束表面形成一层“鞘”状结构，能够阻碍酶与纤维素的结合［22］。由于半纤维素结构中复杂的糖组分，使其在水解后很难被充分利用。例如，玉米纤维的半纤维素结构中含有大量的阿拉伯糖，而阿拉伯糖转化乙醇的途径还未有较大进展。然而杨木的半纤维素几乎只含有O-乙酰基-4-O-甲基-葡萄糖醛酸基-木聚糖这一种结构单元［23］。对比秸秆类木质纤维素原料，其阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等含量极低。虽然野生型发酵微生物不能利用戊糖，但现如今重组酿酒酵母菌株已经具备葡萄糖与木糖的高效共同发酵能力，因此较低的阿拉伯糖含量，较高的葡萄糖和木糖含量能够最大限度增加水解液中可发酵性糖的总量。但是相比于其他木质纤维素生物质，由于杨木半纤维素中的支链通常被乙酰基取代，因此杨木原料中乙酰基含量较高，若想充分利用其半纤维素成分，仍需考虑乙酰基对后续酶解和发酵过程的影响。

1.3 木质素

木质素是由苯基丙烷单元（香豆醇、针叶醇和肌醇）形成的具有三维网络结构的交联聚合物，分别有对羟苯基、紫丁香基和愈创木基3种非晶态无序结构，是一种无定形态的生物高分子。杨木的木质素的结构单元以愈创木基和紫丁香基为主［24］，相较草本和秸秆类原料，其原料中木质素占比较高，但木质素结构中的对羟苯基占比较低。由于木质素易于与酶发生非特异性结合，阻碍纤维素酶对底物的水解，这一特性使其成为限制木质纤维素原料解聚的第一大屏障［25］。因此，“木质素优先”策略是提高杨木生物质酶解效率和减少纤维素酶用量的有效措施之一。

而且目前普遍认为，由于二代燃料乙醇的成本问题，没有木质素的高值化利用，根本无法满足工业化的要求。木质素本身独特的芳香结构决定其在大宗化学品和精细化学品，以及高分子材料、药物分子或高值燃料等高附加值产品的生产方面具有独特的优势［25］。而随着近年的针对木质素高值化利用的研究中，开发了许多能够选择性催化降解的技术，如热催化、光催化、电催化和酶催化等，使得木质素高值化利用成为现实［26］。

2 适用于杨木组成特点的预处理技术

木质素与半纤维素、纤维素之间相互交联，形成碳水化合物-木质素的复合体，其结构质地坚硬且能抵抗酶解，增强了次生细胞壁的生物和物理抵抗性［22］。预处理的主要目的是破坏木质纤维素坚固的物理结构，增加纤维素和半纤维素的可及性，使生物质能被充分水解为可发酵性单糖［27］，进而用于纤维素乙醇和纤维素丁醇等清洁能源的生产，图1显示了杨木生物质燃料乙醇的基本工艺流程。目前基于杨木生物质研究的主流预处理方式主要有：稀酸、蒸汽爆破、稀碱、离子液体以及组合法，如表2所示。

图1 杨木生物质燃料乙醇工艺流程Fig 1 Process flow of poplar biomass fuel ethanol

表2 不同预处理方式对比Table 2 Comparison of different preprocessing methods

2.1 稀酸预处理

稀酸预处理通常采用低浓度的盐酸、硫酸、磷酸或乙酸等酸性试剂，在一定的温度和压力下对木质纤维素进行处理。稀酸预处理能够破坏杨木组分之间的氢键，水解半纤维素，利用其对半纤维素的溶解能力，能够有效降低木质纤维素的结晶度［28］。而且低浓度酸对设备的腐蚀性和危险性更低，更符合工业化的要求。由于稀酸预处理法操作简单且成本廉价，并且能够有效提高纤维素的酶解效率，是目前比较认可的预处理方法之一。Guo等［29］开发了一种利用稀硫酸预处理玉米纤维的简易工业化工艺，可回收81.8%的总糖（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖）。但相较于玉米纤维，杨木原料质地坚硬，木质素含量高。本课题组尝试将杨木进行稀酸预处理，经过预处理条件的优化后，虽然半纤维素的水解效率较优，但纤维素的酶解效率低下（数据未发表）。

2.2 蒸汽爆破预处理

蒸汽爆破预处理是在高温高压的条件下使液态水变成气态水进入原料结构之中，短时间保温后迅速降温减压使水蒸气瞬间喷出。此过程中产生的能量会对木质纤维素内部结构造成破坏，改变木质纤维素本身的结构与化学构成，使其变成疏松的多孔状并溶出半纤维素。蒸汽爆破对原料物理结构的破坏比稀酸预处理更强，并且通过相应的设备可以实现连续化生产作业，是一种公认的高效节能的预处理技术，可以有效辅助原料组分的分离溶出［30］。Biswas等［31］通过对杨木木屑进行湿法爆破预处理条件的优化，得到酶解后的最高总糖产率为76%，并且研究发现随着预处理条件强度的增加，能够得到更高的葡萄糖糖化率。然而相关研究证明，过度的预处理条件不仅无法继续提高总糖的糖化率，还会生成更多的糠醛、5-HMF等抑制物［32］，而且蒸汽爆破预处理仍然无法解除木质素对酶解过程的影响。

2.3 稀碱预处理

木质素作为一种对蛋白质具有非特异性结合能力的物质，无法对杨木生物质实现较高的酶解效率。为了改善这一现象，采用稀碱预处理对原料进行“木素先行”的策略。稀碱预处理主要是利用低浓度的氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化钠等碱性试剂溶解木质素和半纤维素，从而破坏木质纤维素材料的坚固性［33］，而且在预处理过程中不会产生乙酸、糠醛、5-HMF等抑制物。但通过Bay等［5］研究发现，氢氧化钠预处理虽然能够破坏木质纤维素致密的结构，但木质素脱除率较低，半纤维素损失严重，葡萄糖产率较稀酸预处理更低，其原因在于稀碱预处理条件更加温和，导致对杨木生物质结构破坏能力较弱，降低了底物对酶的可及性。

2.4 离子液体预处理

因存在如何高效脱除木质素、提高纤维素保留率、降低预处理成本等问题，可重复利用的低共熔溶剂成为近年研究的热点。低共熔溶剂是氢键受体和氢键供体以一定的化学计量比混合而成的。作为一类新的离子液体或离子液体类似物，具有类似离子液体的物理化学性质。皮奇峰等［34］研究发现，低共熔溶剂对杨木的木质素脱除率大于90%，纤维素保留率大于98%，半纤维素溶解率亦达到76%。同时周敏姑等［35］研究发现，低共熔溶剂能够有效脱除杨木原料的木质素，增加葡萄糖得率，但溶解的半纤维素较难分离与转化，降低了木质纤维素原料的全糖共利用率。而提高全糖共利用率，能够有效降低纤维素乙醇的生产成本。因此寻找高效专一脱除木质素的预处理方法，是执行“木素先行”策略的重要前提。

2.5 组合法预处理

使用单一预处理方法往往不能达到理想的预处理效果，通过对两种及两种以上预处理方法进行组合，综合不同预处理的优点，使预处理效果更为显著。因此，组合法预处理方式是解决杨木生物质木质纤维素解聚的有效方式之一。尽管储秋露等［36］研究发现，碱性氧化和碱性磺化结合蒸汽爆破预处理后，杨木木质素脱除率均达到50%左右，纤维素和半纤维素回收率比蒸汽爆破预处理更高，但葡萄糖糖得率仍然较低。Shi等［37］研究发现，稀酸-稀碱预处理对半纤维的水解效果较佳，并能够脱除部分木质素，但其效率低下还伴随着纤维素的损失。因此，对于杨木等木质素含量高的原料，常规的预处理很难达到理想的木质素脱除效果。Wen等［38］研究了基于杨木的乙酸-亚氯酸钠二步法预处理发现，亚氯酸钠预处理可脱除70%以上的木质素，保留82%以上的葡聚糖，具有较高的水解葡萄糖产率。相关研究表明，亚氯酸钠仅对木质素具有较好的溶解作用，几乎不溶解纤维素和半纤维素［4］。这种高效且专一的脱木质素预处理，不仅能够减少原料中木质素含量，提高酶解效率，而且能够最大程度保留原料的糖组分。

综合各种预处理方式，本课题组对杨木生物质的亚氯酸钠预处理法进行探究发现，木质素脱除率达到70%，葡聚糖和木聚糖的损失均小于5%。预处理后的杨木三大组分比例发生了明显变化，木质素含量下降到约8%，葡聚糖和木聚糖的比例相对增加。此时的杨木结构已被部分破坏，因此后续采用较低强度的稀硫酸预处理条件，可以解聚56%的木聚糖（数据未发表）。尽管经过酶解后葡萄糖和木糖的总糖化率可达到理论值的90%左右，但此预处理组合方法也存在一些问题。由于亚氯酸钠具有一定毒性，对存储条件要求高，因此大规模工业生产中的应配套相应的安全设施。另外，亚氯酸钠具有强氧化性，预处理脱除的木质素被氧化后，其基本结构已发生变化，暂无研究表明能够将亚氯酸钠溶出的木质素回收利用。

3 预处理原料的酶解

现代工业中，酶解工艺对设备要求低、对环境友好，利用纤维素酶进行加工生产的技术较为成熟。经过预处理后的木质纤维素结构被破坏，纤维素裸露出来，能够有效提高纤维素酶的解聚效率。酶解工艺的高效性及经济性是制约二代燃料乙醇发展的关键之一，因此纤维素酶系的配比、高产纤维素酶菌株的选育及酶解工艺参数的优化对不同原料的酶解效率至关重要，如表3所示。

表3 影响预处理原料酶解的因素Table 3 Factors affecting the enzymatic digestion of the pretreatment ingredients

3.1 多酶体系复配

纤维素降解酶系通常是由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和氧化裂解酶等组成，每种酶组分能够降解专属的糖苷键。其中纤维素酶主要包括3类基本酶组分，分别是随机劈开纤维素纤维内部的β-1,4糖苷键，释放自由短链的内切葡聚糖酶；从游离链末端依次切割纤维二糖单元的外切葡聚糖酶；进一步水解纤维二糖释放葡萄糖单元的β-葡萄糖苷酶［39］。杨木生物质具有占比较高的纤维素成分，因此要求所用纤维素酶系具有较高的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组分。大量研究表明，在纤维素酶水解过程中额外添加β-葡萄糖苷酶可以有效提高酶解效率和糖化率。另外，纤维素酶系中复配木聚糖酶，能够有效降解预处理未能解聚的半纤维素。同时，裂解多糖单加氧酶发现，通过利用其氧化裂解作用，可以破坏纤维素的结晶结构，为糖苷水解酶提供更多的结合位点，也对纤维素的高效酶解起到重要作用［40］。这说明高效的酶解不仅需要较高的加酶量，酶系的组成配比同样至关重要。

3.2 高效纤维酶系的菌种选育

目前，用于生产纤维素酶的微生物菌种主要是产酶活力较强的青霉菌、曲霉菌和木霉菌等丝状真菌。尤其是里氏木霉，具有良好的抗代谢抑制能力和较高的产酶活力，而且纤维素酶系齐全，具有分解天然纤维素所需要的3类酶组分［41］。同时，里氏木霉对生长环境要求较低、菌株安全无毒、酶组分易于提取，是公认的纤维素酶生产菌，最具工业应用价值［42］。而与木霉菌相比，青霉菌的木质纤维素分解酶系主要由纤维素降解酶、半乳糖分解酶和其他蛋白质成分组成，酶组分比较齐全，且各酶组分之间的比例较为均衡［43］。曲音波等［44］从土壤中分离出一株青霉纤维素酶生产菌株，其抗降解物阻遏高产突变株先后在宁夏夏盛公司和甘肃白银赛诺公司得到应用，随后又在山东龙力公司的纤维素乙醇生产中得到进一步验证，并通过对酶合成调控网络的合理重构，进一步改造该菌株，提高产酶能力。为获得性能优良的高产酶能力菌株，还可以通过理化诱变育种、原生体融合育种、基因工程和分子修饰等技术来实现纤维素酶生产菌的遗传改良。

3.3 高浓度底物酶解

为了获得较高乙醇浓度的发酵液，学者们通常采用提高底物的添加量，获得高糖浓度酶解液的方法来实现，此方法生物质固体含量一般在20%以上。Ying等［45］利用经过乙酸和过氧化氢预处理后的原料进行高固体含量的酶解测试，在40%固体载量的条件下进行酶解，葡萄糖浓度达到250.8 g/L。但在高固体含量的酶解过程初期，反应体系中的自由水被大量的底物吸收。而酶解反应需要水分子作为载体，自由水的减少导致酶解反应体系无流动性，传质过程减缓，使底物与酶无法充分结合，酶解效率降低。da Silva等［46］研究发现，可以通过批次投料的酶解方式解决这一问题，分批补料后的固体载量可以达到40%，葡萄糖的得率达到60%以上。分批补料通过逐次添加少量底物使反应体系一直保持较高的流动性，从而保证底物与纤维素酶的充分接触，达到更好的酶解效果。

除了原料自身结构对酶解的影响，酶解温度和溶液pH等因素也对酶解效率具有重要的影响。因此在酶的最适温度（45-55℃）和最适pH（4.5-6.5）范围内能够有效保证酶解效率，而加酶量则需根据对酶解效率以及成本的要求作出选择。本课题组通过对比诺维信（Cellic CTec 3）和赛诺两种纤维素酶对杨木生物质的酶解性能发现，添加相同滤纸酶活单位时，诺维信纤维素酶的效果更佳。随后，对两者的部分酶组分的酶活测定发现，诺维信纤维素酶中的β-葡萄糖苷酶酶活高于赛诺纤维素酶。结合杨木具有较高葡聚糖含量的特性，在高固体载量酶解的过程中，额外添加β-葡萄糖苷酶能够使酶解效率提升约60%（数据未发表）。因此，增加纤维素酶中β-葡萄糖苷酶的配比能够有效提升酶解效率，还有助于消除纤维二糖积累造成的反馈抑制。

4 原料水解液的发酵

微生物发酵在燃料乙醇生产工艺中具有重要的地位，水解液和微生物的发酵性能直接影响到转化效率和乙醇产量。如何实现水解液的全组分高效转化，是制约二代燃料乙醇发展的主要障碍之一。大量研究发现，可以通过降低水解液毒性、强化微生物发酵性能、优化发酵参数等方式，破除阻碍其发展的屏障，如表4所示。

表4 提升原料水解液发酵性能的方式Table 4 Ways to improve the fermentation performance of the raw material hydrolysate

4.1 水解液中发酵抑制物及其脱毒方法

抑制物伴随着木质纤维素解聚过程产生，对微生物的生长代谢具有毒害作用。因此，人们尝试多种方法来降低木质纤维素水解液的毒性，通常有物理脱毒法、化学脱毒法及组合脱毒法。原料的差异及预处理措施的差异使得预处理液的毒性不同，因此需要根据预处理液对发酵微生物的影响，选择合适的脱毒方法。研究发现，潜在的木质原料抑制物种类多达35种，主要来源于糖和木质素的降解化合物以及木材提取物，包括芳香族醛和酸、脂肪族醛和酸以及呋喃化合物［47］。而杨木经过稀酸预处理后，高温和氢离子的催化会产生乙酸、5-羟甲基糠醛、糠醛和酚类（间苯二酚、对苯二酚）等抑制物［48］。

化学脱毒法利用各种碱性试剂对预处理液进行处理，如氨水、氢氧化钠、氢氧化钙、生石灰等。通过碱性试剂脱毒后，能够有效缓解有机酸对发酵微生物的毒性作用，提高糖利用率［49］。杨木原料组分中乙酰基含量较高，随高固体含量的酶解液乙酸浓度增加，简单的化学法无法满足脱毒的需求。物理法包括减压蒸发、溶剂萃取、活性炭吸附、絮凝纳滤和离子交换吸附等方式，减压蒸发和溶剂萃取能够脱除挥发性和有机性抑制物，活性炭处理能够去除更多的酚酸，离子交换树脂可以有效减少乙酸、糠醛、5-HMF以及酚类这些常规抑制物［50-53］。选择物理法和化学法组合使用，能够更加有效的降低水解液抑制物浓度，降低抑制物对酶解过程和发酵过程的影响［54］。张强等［55］研究发现，氢氧化钙结合活性炭吸附的组合脱毒法对杨木水解液进行脱毒，乙醇转化率明显提升。徐勇等［56］采用不同碱性试剂，结合弱碱性阴离子交换树脂或减压蒸发进行脱毒发现，减压蒸发加石灰中和的脱毒方法最佳，可脱除70%乙酸和40%甲酸，仅有5.0%-6.0%糖损失，脱毒后微生物的糖利用率和乙醇得率可提高到93.2%和83.6%，对乙醇发酵具有积极的促进作用。

但是，脱毒步骤增加了二代燃料乙醇的生产成本，使生产工艺变得复杂，同时伴随部分可发酵性糖的损失。本课题组测试了树脂和活性炭对抑制物的脱除效果，实验发现树脂比活性炭的脱毒效果更优，但树脂的脱毒效果也存在一定的局限性，当固定体积的树脂流过少量水解液时，树脂对抑制物的吸附效果显著，但糖的损耗也更高；而流过大量的水解液时，树脂吸附能力和被吸附的抑制物逐渐饱和，随之脱毒效果变差；而且树脂的活化与再生，也需要消耗大量的物力和时间（数据未发表）。所以在工业生产中，应尽量避免脱毒步骤。可以通过提高菌株自身耐受力，或优化发酵过程控制，降低或消除抑制物对发酵微生物的影响。

4.2 二代燃料乙醇酿酒酵母的定制

由于二代燃料乙醇原料及生产加工过程的差异性，要求发酵菌株能够更好地适应不同的水解液环境，对于微生物来说是困难的。而定制的二代燃料乙醇发酵微生物只需适应专属的水解液，不仅降低了微生物选育的难度，同时更加有利于工业化生产，因此开发适配于杨木水解液的专用发酵菌株势在必行。根据原料的特点，杨木的半纤维素含量占比高达到15%，C5/C6双糖共利用能够有效提高生产工艺中的全糖利用率，提高燃料乙醇的经济性。而抑制物的存在，使得高效利用可发酵性糖兼具高鲁棒性的菌株开发，成为制约二代燃料乙醇经济可行性的重要因素之一。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种传统的乙醇发酵生产菌种，具有优良的生产性能，是适合转化包括第二代燃料乙醇在内的生物基化合物的理想底盘细胞［57］。随着分子生物学的发展与进步，传统发酵菌株无法高效利用五碳糖的困难已被解决，C5/C6双糖共发酵微生物的定制，使木质纤维素解聚生产化学品成为现实。利用适应性进化、代谢工程以及合成生物学等策略，能够改善葡萄糖和木糖的共发酵能力［58］。亓伟等［59］将酿酒酵母Saccharomyces-cerevisiae NRRL Y-2034 和树干毕赤酵母Pichia stipitis NRRL Y-7124原生质体融合培养，获得菌株融合子F11，能够利用葡萄糖和木糖生产乙醇。本实验室前期在野生型二倍体酿酒酵母菌株BSIF染色体的PHO13基因座位上，插入克隆自牛瘤胃液宏基因组的木糖异构酶基因Ru-xylA（GenBank JF496707），实现了木糖异构酶的异源表达；同时在GRE3基因位点上插入含有磷酸戊糖途径非氧化部分的4个基因独立表达框，使GRE3基因失活，减少副产物木糖醇的生成；随后通过在染色体上替换组成型强启动子TEF1p来达到木酮糖激酶的基因XKS1的适度超表达，增强下游代谢通量，同时进一步整合Ru-xylA基因表达框，增加基因拷贝数，得到菌株BSN3；然后将其在以木糖为唯一碳源的培养基中驯化，选择出生长最快的单菌落XH7；之后用玉米秸秆预处理沥出液作为复合毒性驯化培养基，利用BioScreen system筛选出单菌落比生长速率最大的XRH11；在其染色体上整合异源转运蛋白突变子N360S，使其具有转运木糖的能力，同时对菌株进行驯化，得到菌株LF1［60］。但研究中也发现，以木质纤维素为原料的水解液往往含有较高浓度的抑制物，因此进一步对菌株LF1进行非理性适应性驯化，得到了一株木糖利用与鲁棒性这一拮抗关系较为平衡的菌株6M-15［61］。随着各种C5/C6双糖共利用以及高鲁棒性微生物的开发，以木质纤维素为原料的生物合成产业得到进一步的发展。

4.3 发酵方式选择

工业中微生物发酵的方式主要有3种，分别为间歇发酵、连续发酵和批式流加发酵［62］，合适的发酵方式，能够有效降低生产成本，提高经济效益。但研究发现，在葡萄糖木糖共发酵时会出现葡萄糖后继效应，表现为发酵后期木糖代谢缓慢［63-64］。因此许多研究人员提出同步糖化发酵和半同步糖化发酵，希望在缓解上述现象的同时减少工艺步骤和缩短工艺时间［65］。而Kim等［66］通过分批补料间歇同步糖化发酵的策略，使杨木水解液56 h时乙醇得率达到81.7%，乙醇浓度仅达到39.9 g/L。Chen等［67］通过批式流加发酵结合同步糖化发酵的操作，在所有4种以玉米秸秆为原料，以开发的酿酒酵母为发酵菌株的发酵中，都实现了约85 g/L乙醇浓度。但由于酶解和发酵最适温度的不一致性，必然要造成酶解效率的损失。因此，将分批补料酶解单独进行，能够有效增加酶解效率，然后再通过批式流加发酵，有利于缓解葡萄糖后继效应。

4.4 发酵过程控制

生物发酵需要为生物体创造适宜的生长条件，使其在适宜的温度、pH值、营养浓度和通气量等条件下进行生长繁殖和代谢，提高发酵产率和效率［68］。优化微生物发酵的过程控制，能够有效提高微生物发酵的经济利益和产品质量［69］，而杨木生物质乙酰基含量丰富，导致杨木水解液乙酸浓度较高。虽然二代燃料乙醇发酵菌株通常具有一定的鲁棒性，但超过发酵菌株所能承受的抑制物浓度后，亦会导致微生物无法正常生长代谢。乙酸作为一种发酵抑制物，在发酵的过程中会产生不利的影响，其解离常数pKa值为4.75。因此在pH小于等于4.75的水解液中，大多数乙酸以分子形式存在。而乙酸分子具有亲脂性的特点，可以通过自由扩散进入细胞，在细胞质中被解离的乙酸分子导致细胞内部酸化，从而对微生物产生毒性作用［70］。而且经过Casey等［71］研究发现，增加培养基的pH值可以降低乙酸的抑制作用，从而证实了乙酸的未解离形式是该分子的抑制形式。本课题组也通过调节水解液pH来缓解乙酸的抑制作用，研究发现，当pH高于4.75时，能够有效提高木糖利用率、发酵液乙醇浓度和糖醇转化率（数据未发表）。

另外，在种子培养过程中，用部分含抑制物的水解液进行种子活化，或增加发酵微生物初始细胞浓度，都能够增强微生物发酵能力，有利于后续乙醇发酵［72］。酵母菌作为兼性厌氧菌，发酵前期需要适量氧气使菌体快速生长繁殖［73］。而通过实验发现，菌体生长过度会消耗更多的葡萄糖，因此通过优化通气量来控制菌体生长，同样有利于提高发酵液的乙醇浓度。

5 展望

世界各国对生物质燃料乙醇的研究已开展多年，现有生产工艺也取得较大的进展并实现工业化应用。但对于林木类生物质的研究还停留在预处理和酶解阶段，原因在于林木类原料自身的物理结构和化学成分的特殊性。所存在的问题主要体现在预处理过程复杂、成本高和成分损失等方面。而对于林木类二代燃料乙醇的发展，需要预处理、酶解和发酵3个阶段的统筹规划，因此困难不仅仅在于预处理阶段。通过对现有预处理技术的不断优化，以期获得高效预处理方法；通过开发性能优良的产酶菌株和先进的酶解装置，以期获得高效的酶解方法；通过发酵微生物的定制以及发酵方式和过程控制的优化，以期探索生物制乙醇的可行性发酵工艺。随着环保概念的深入人心，开发可再生能源的需求势在必行。提高以杨木生物质为原料的二代燃料乙醇生产过程的经济性，基本要求主要有两点：一是实现杨木生物质的全组分利用，二是开发高效适配的预处理、酶解和发酵交叉耦合工艺。因此，提升二代燃料乙醇发酵微生物的全糖共利用能力和鲁棒性，以及形成优势互补的交叉学科研究和交叉耦合工艺探索，仍是未来关注的热点。