张岳一 兰社益 裴海闰 封棣

（北京工商大学轻工科学技术学院，北京 100048）

燕麦（Avena sativa L.）富含蛋白质和膳食纤维，尤以球蛋白与β-葡聚糖含量最高［1］，在禾谷类粮食中均居首位。麸皮是燕麦加工中的主要副产物，廉价易得，相比于燕麦胚乳，麸皮中蛋白所占比例更高，可达到15%-20%，除此之外，燕麦β-葡聚糖也在麸皮的糊粉层和亚糊粉层中富集［2］。

燕麦蛋白经过降解，可获得比原蛋白生物活性更好的燕麦多肽，燕麦多肽较燕麦蛋白具有更好的加工性能、理化性能、水合性质以及溶解性［3］。ProvitalGroup公司生产的HydrolyzedOat由控制酶法水解燕麦蛋白制得，添加至护发类产品中，起到调理、修复、成膜保湿等作用。对成纤维细胞的增殖和皮肤胶原蛋白的合成均具有显著的促进作用［3］。多肽可作为发用洗护产品的原料，小分子多肽有利于毛发吸收，并帮助恢复角蛋白中的二硫键，修护毛鳞片角蛋白［4］。目前燕麦多肽制备多采用酶解法，陈敏［5］以燕麦粉为原料，使用碱性蛋白酶制备燕麦多肽，得率达17.02%。但是蛋白质通过酶解获取多肽会产生苦味和臭味，影响产物的感官品质，且费用较高。

燕麦麸皮中的β-葡聚糖具有较强的吸附小分子的能力，能和多酚通过氢键、疏水相互作用等结合，形成的多糖多酚复合物能为机体提供持久的抗氧化能力［6］。燕麦β-葡聚糖的大分子结构可作为天然保湿剂添加到发用化妆品中，β-葡聚糖分子覆盖于头发表面可起到增加发丝湿度、强度的作用，强化头发的韧性［7］。且因其具有保湿性，能够改善头皮屑、皮脂和发痒。目前燕麦β-葡聚糖的提取方法主要有水提法、热提取法、超声辅助提取法等。热提取法的提取条件较为温和，因此能够在较大程度上保留β-葡聚糖的物理性质，可作为一种β-葡聚糖的基础提取方法。李楠等［8］以燕麦全粉为原料，采用热提法制备燕麦β-葡聚糖，得率达4.36%。但热提法料液过于浓稠，不易分离，提取效率较低。

虽然分别提取燕麦多肽和β-葡聚糖已经达到较高得率，但目前常用的提取方法尚存在一定缺陷，相比之下，发酵提取法具有反应条件温和简单、提取率高、产物活性高及废料可回收等优势［9］。盖梦等［10］使用枯草芽孢杆菌发酵燕麦制备降压肽，血管紧张素转化酶抑制活性达63.96%。刘新琦等［11］通过接种高活性干酵母发酵提取β-葡聚糖，得率为5.21%，与传统水提法相比提高了60.8%。然而，通过一次性工艺同时提取燕麦多肽与燕麦β-葡聚糖的研究较少，现有文献中也缺少两种混合功能成分应用到护发类化妆品的评价。因此，本研究将通过多菌种联用发酵法同时提取燕麦多肽和燕麦β-葡聚糖，并与热提取燕麦β-葡聚糖和酶解提取燕麦多肽进行比较，对3种提取液的功能成分得率、抗氧化活性、抑菌活性与发用功能进行研究分析，以期为燕麦麸皮发酵液发用领域的应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 无菌操作台SW-CJ-1FD，广州瑞智净化设备有限公司；全温振荡培养箱TCYQ，苏州市培英实验设备有限公司；恒温生化培养箱LRH-70，上海一恒科学仪器有限公司；可见分光光度计VCX130，苏州索尼克超声科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌器LS-35HD，江阴滨江医疗设备有限公司；酶标仪MULTISKAN MK3、SEM扫描电镜Q45，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；扫描差热分析仪Q20，沃特世科技（上海）有限公司。

1.1.2 试验材料 燕麦麸皮，市售；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）AS1.892、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC1.807、糠秕马拉色菌（Malassezia furfur）ATCC4434、大肠埃希菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄链球菌（Staphylococcus aureus）：北京生物保藏中心；高活性干酵母（Saccharomyces）：安琪酵母股份有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂：北京奥博星生物技术；葡萄糖、七水合硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：福晨化学试剂有限公司；碱性蛋白酶Alcalase 3.07（1.8×105U/g）：诺维信Novozymes；纤维素酶（1.0×105U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：梯希爱化成工业发展有限公司；3-乙基-2-亚硝基亚胺-2,3苯噻唑（ABTS）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-抗坏血酸（维生素C, Vc）：北京索莱宝科技有限公司；过氧化氢：北京化工厂；水杨酸：北京博奥拓达科技有限公司；十二烷基醚硫酸钠（SLES）：山东金丽源化工科技有限公司；标准发束17 cm × 1.5 cm、蓬松发束27 cm × 1.0 cm。

1.1.3 培养基 LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0、酵母浸出粉5.0、氯化钠10.0；Leeming & Notman培养基（g/L）［12］：蛋白胨10.0、葡萄糖10.0、酵母浸粉1.0、牛胆盐4.0、甘油1.0、单硬脂酸甘油酯0.5、吐温60（聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯）1.0、全脂奶10.0、橄榄油40.0、氯霉素0.5。

1.2 方法

1.2.1 热提取法制备β-葡聚糖提取液（heating extract, HE） 燕麦β-葡聚糖提取采用热提法［8］。取燕麦麸皮5 g，加105 mL蒸馏水（料液比1∶21）于250 mL烧杯中，搅拌混合使料液成均匀分散体系，用浓度1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至10.9，将料液置于85℃水浴中搅拌加热1.9 h。提取结束后用浓度1 mol/L的HCl溶液调节pH值至7.0，离心取上层液，定容至100 mL。

1.2.2 酶解法制备多肽提取液（enzyme extract,EE） 燕麦多肽提取采用酶解法提取［13］。取燕麦麸皮5 g，加50 mL蒸馏水（料液比1∶10）于250 mL烧杯中，添加纤维素酶15 mg与碱性蛋白酶150 mg，搅拌混合使料液呈均匀分散体系，用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0-9.5。60℃水浴搅拌加热3 h后，用浓度1 mol/L的HCl溶液调节pH值至7.0，离心取上层清液，定容至50 mL。

1.2.3 菌种接种比确认 在料液比为1∶10的燕麦麸皮培养基中分别以2%（体积分数）的总接种量接种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌与酵母菌的菌液进行发酵培养，接种比例保持（枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌）∶酵母菌=2∶1，其中枯草芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌分别为9∶1、7∶3、5∶5、3∶7和1∶9；发酵过程中第2、4、6、8、10、12、18、24、30和36小时取发酵液稀释一定倍数，涂布至LB培养基中统计菌落形成单位（CFU），每组实验设3个平行。

1.2.4 燕麦麸皮发酵液（fermented extract, FE）制备与发酵工艺优化

1.2.4.1 单因素实验 选取发酵时间（18、24、30、36、42和48 h）、接种量［1%、2%、3%、4%、5%和6%（体积分数）］、料液比（1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶30）和发酵温度（28、30、32、34、36和48℃）为单因素，其他条件保持一致，发酵结束后再次灭菌，用浓度1 mol/L的HCl溶液调节pH值至7.0，离心取上层清液定容至30 mL，每组实验设3个平行。

1.2.4.2 正交试验 在单因素试验的基础上，进行四因素三水平正交试验，正交试验因素水平如表1所示。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 多肽得率测定 采用双缩脲法检测多肽含量。取18支试管分3组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的10 mg/mL标准牛血清蛋白溶液，用蒸馏水补足到1 mL，加入4 mL双缩脲试剂A液与0.2 mL双缩脲试剂B液。充分摇匀后室温（20-25℃）放置30 min，于540 nm波长下测定吸光度。未加蛋白质溶液作为空白对照液。以蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

多肽得率计算公式

式中 C：多肽的质量浓度（mg/mL）；V：样品总体积（mL）；m：燕麦麸皮质量（g）。

1.2.6 β-葡聚糖得率测定 采用刚果红法检测β-葡聚糖含量［14］。取18支试管分3组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的0.1 mg/mL β-葡聚糖标准溶液，用蒸馏水补足到2.0 mL，加4.0 mL刚果红溶液摇匀后室温（20-25℃）放置10 min，于550 nm波长下测定吸光度，以0号管中反应液作空白调零。取测定的平均值，以葡聚糖的含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。β-葡聚糖得率计算公式如下：

式中 C：葡聚糖的质量浓度（mg/mL）；V：样品总体积（mL）；m：燕麦麸皮质量（g）。

1.2.7 抗氧化活性测定

1.2.7.1 DPPH·清除活性的测定［15］将发酵液、葡聚糖提取液、多肽提取液用蒸馏水配制成浓度为1、5、10、25、50、100、200、400、800 mg/mL的溶液。选取0.1 mg/mL的维生素C溶液作为阳性对照。取2 mL不同浓度的样液与2 mL DPPH溶液加入离心管充分混合，室温下避光反应30 min，离心1 min，取上层清液于517 nm测定吸光值A。计算公式如下：

式中，A0为DPPH溶液+无水乙醇在波长517 nm处吸光度；A1为DPPH溶液+样品溶液在波长517 nm处吸光度；A2为无水乙醇+样品溶液在波长517 nm处吸光度。

1.2.7.2 ABTS清除活性的测定 溶液配制同1.2.7.1。选取0.4 mg/mL的维生素C溶液作为阳性对照。取200 μL样品加入10 μL ABTS溶液，室温下静置6 min，于734 nm测定吸光值A。计算公式如下：

式中，A0为ABTS溶液+蒸馏水在波长734 nm处吸光度；A1为ABTS溶液+样品溶液在波长734 nm处吸光度；A2为蒸馏水+样品溶液在波长734 nm处吸光度。

1.2.7.3 羟自由基清除活性测定 各组样品溶液浓度为10、15、25、50、100、200、400、800 mg/mL。选取2.0 mg/mL的维生素C溶液作为阳性对照。取200 μL样品于536 nm测定吸光值A。计算公式如下：

式中，A0为蒸馏水+ FeSO4溶液+ H2O2溶液+水杨酸溶液在波长536 nm处吸光度；A1为样品溶液+ FeSO4溶液+ H2O2溶液+水杨酸溶液在波长536 nm处吸光度；A2为样品溶液+FeSO4溶液+蒸馏水+水杨酸溶液在波长536 nm处吸光度。

1.2.8 抑菌活性测定

1.2.8.1 菌悬液制备 将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接于LB培养基，37℃培养18 h取出，使用无菌水调整菌悬液浓度约106-107CFU/mL，取马拉色菌接种于Leeming & Notman培养基，37℃培养5 d取出，使用无菌水调整菌悬液浓度约106-107CFU/mL。

1.2.8.2 抑菌圈的测定 通过纸片法测定提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、马拉色菌的抑菌圈直径。吸取100 μL菌悬液滴加到对应的琼脂平板上涂布均匀，待其表面无水后用无菌镊子将直径6 mm的灭菌滤纸片贴附于培养基上，吸取20 μL燕麦麸皮提取液滴至滤纸片上，对照组使用等量无菌水。金黄色葡萄链球菌、大肠埃希菌37℃培养18 h，马拉色菌37℃培养5 d后取出，测量抑菌圈直径，每组做5个平行。

1.2.8.3 最小抑菌浓度测定［16］将梯度稀释的提取液与琼脂培养基等体积混合，制备递减浓度抑菌药物平板，然后把细菌点种在培养基的表面，金黄色葡萄链球菌、大肠埃希菌37℃培养18 h，马拉色菌37℃培养5 d，抑制受试菌种生长的最低抑菌物质浓度，即为最小抑菌浓度。

1.2.9 发用功效评价

1.2.9.1 光泽度改善 将发束用10% SLES进行基础清洗，平衡干燥后，使用光泽度测试仪测量发束的光泽度参数值，每束发束均匀测量10次。随后再以10% SLES进行清洗。样品组取约0.2 g样品均匀涂抹于发束上，对照组使用等量蒸馏水操作，揉搓1 min，停留10 min，蒸馏水洗净。完成后将发束悬挂在（26±2）℃，（60±10）%相对湿度的恒温恒湿室中干燥平衡24 h，再次测量发束的光泽度参数值10次。

1.2.9.2 修护毛鳞片能力 发束处理与样品使用方法与1.2.9.1相同，从经处理发束中随机取10-20根发丝，对发丝进行电镜扫描。

1.2.9.3 干梳理性 发束处理与样品使用方法与1.2.9.1相同，使用头发多功能测试系统（Combing）进行发束的干梳测试，记录干梳理功与干梳理最大负荷，每个样品重复5次。

1.2.9.4 α-角蛋白还原能力 发束处理与样品使用方法与1.2.9.1相同，将发束切割成1.0 mm左右的片段，选取15组发束片段，使用扫描差热分析（DSC）仪测试头发的DSC曲线，获得吸收峰峰值温度（Td）和平均吸收峰面积（△Hd），并计算相对螺旋含量（RHC），RHC越小，头发受损程度越大：

1.2.10 数据统计分析 实验所得数据结果均以“mean±SD”的形式表示，使用正交设计助手软件进行正交设计与分析，利用OriginPro 2021软件对试验结果进行整理作图、IC50计算和显著性分析。

2 结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 菌种接种比优化 如图1所示，在所有接种比例下，地衣芽孢杆菌生长曲线为经典S形，但有较长迟滞期，均在8 h活菌数最少，随后菌量再次增长。发酵液黏度在发酵3 h后下降，鉴于此时仅枯草芽孢杆菌生长，应为该菌产生的蛋白酶快速降解料液中蛋白质导致，溶氧量增加枯草芽孢杆菌数量快速上升但很快被抑制，后期不同接种比的枯草芽孢杆菌均出现第二次生长。增加地衣芽孢杆菌接种比例，当枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌接种比7∶3时，两菌种的活菌数在发酵后期都能达到最大（图1-B）。然而，进一步增加地衣芽孢杆菌接种比，并没有缩短迟滞期，且两菌种的活菌数均有所下降，可能是燕麦麸皮中β-葡聚糖的释放，增加了料液黏稠度，减缓菌种繁殖速度和生物量。菌种生长受多方面因素影响，从生长曲线观察在枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌接种比7∶3时，两菌种均有相对较好的活力，后续将选用7∶3接种比对燕麦麸皮进行发酵提取。

图1 枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌在接种比9∶1（A）、7∶3（B）、5∶5（C）、3∶7（D）和1∶9（E）时的生长曲线Fig.1 Growth curves of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis in inoculation proportion of 9∶1（A）, 7∶3（B）,5∶5（C）, 3∶7（D）and 1∶9（E）

2.1.2 提取工艺条件优化 随发酵时间的延长，燕麦多肽及燕麦β-葡聚糖得率均上升，36 h时葡聚糖得率达到最高得率5.23%，42 h时燕麦多肽得率达到最高得率14.33%（图2-A），之后随发酵时间延长，得率持平不再上升，发酵至42 h时反应已充分，继续延长时间得率也不再提升。当总接种量为2%（体积分数）时，多肽和β-葡聚糖得率均达到最高，分别为15.33%和5.21%，其中多肽得率呈现出先上升再下降的趋势（图2-B）。发酵温度30℃时，多肽和β-葡聚糖得率均达到最高，分别为15.36%和5.30%（图2-C），此时枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌均处于相对适宜的生长温度。当料液比为1∶7.5时，多肽得率、β-葡聚糖得率均达到最大，分别为15.62%和5.84%（图2-D），当料液比由1∶7.5降至1∶10时，得率开始下降，原因或为料液过稀不能为菌种提供足够营养从而影响提取效率。

图2 发酵时间、接种量、温度和料液比对多肽、β-葡聚糖得率的影响Fig.2 Effects of fermentation time, inoculation volume, temperature and solid-liquid ratio on peptides and β-glucan yield

2.1.3 正交试验结果 正交结果如表2所示。由极差分析可知，料液比A、发酵温度B、发酵时间C、接种量D对得率的影响大小依次为A＞D＞C＞B，最佳工艺条件为料液比1∶7.5，发酵温度30℃，发酵时间42 h，接种量3%（A2B2C3D2），后经实验验证，该条件下制备发酵液多肽得率16.21%，β-葡聚糖得率5.98%。

表2 正交试验结果及分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

2.1.4 不同提取方法多肽、β-葡聚糖得率对比 如图3所示，热提取法和酶解法仅对一种功能因子有较高的提取效率，发酵提取可同时高效提取多肽和β-葡聚糖。葡聚糖提取液黏稠度高，澄清度较低；多肽提取液有较明显的苦臭味，轻微浑浊，上层有难处理的漂浮物；发酵液呈琥珀色，透明澄清，有类似水果香气，或因酵母在发酵过程中消耗原料中淀粉等物质，改善感官品质。

图3 不同提取方法多肽、β-葡聚糖得率对比Fig.3 Comparison of peptide and β-qlucan yields by different extraction processes

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH清除率 如图4-A所示，葡聚糖提取液、多肽提取液与发酵液对DPPH自由基均具有较为显著的清除作用，发酵液的清除率最高达到89.00%。在50-200 mg/mL范围内，发酵液对DPPH自由基的清除率由19.53%上升至73.09%。图4-B反映了不同提取液对DPPH自由基的IC50值，发酵液IC50值为89.35 mg/mL，低于0.1 mg/mL维生素C（135.80 mg/mL），具有显著性差异（P＜0.001）。

图4 不同提取方法DPPH清除率与IC50对比Fig.4 Comparison of DPPH clearance rate and IC50 under different extraction methods

2.2.2 ABTS清除率 如图5-A所示不同提取液对ABTS均具有较为显著的清除作用，发酵液与多肽提取液的清除率均达到99.40%。在浓度50 mg/mL 时，发酵液对ABTS的清除率即达到75.02%，且在0-200 mg/mL浓度范围内，清除率高于其他组。图5-B反映了不同提取液对ABTS的IC50值，发酵液的IC50值为1.315 mg/mL，显著低于0.4 mg/mL维生素C（2.366 mg/mL）。

图5 不同提取方法ABTS清除率与 IC50 对比Fig.5 Comparison of ABTS clearance rate and IC50 under different extraction methods

2.2.3 羟自由基清除率 如图6-A所示不同提取液对羟自由基均有清除作用，发酵液的清除率达到93.00%，与2.0 mg/mL的维生素C相当。图6-B反映了不同提取液对羟自由基的IC50值，发酵液的IC50值为91.26 mg/mL，低于2.0 mg/mL维生素C的107.74 mg/mL。

图6 不同提取方法的羟自由基清除率与 IC50 对比Fig.6 Comparison of hydroxy radical scavenge rates and IC50 under different extraction methods

2.3 抑菌活性

由表3可知，葡聚糖未显现抑菌性。多肽提取液对金黄色葡萄链球菌的MIC为6.25 mg/mL，对大肠埃希菌的MIC为6.25 mg/mL，而对马拉色菌的MIC为1.56 mg/mL；发酵液对金黄色葡萄链球菌的MIC为6.25 mg/mL，对大肠埃希菌的MIC为3.12 mg/mL，而对马拉色菌的MIC为6.25 mg/mL。相比于其他方法，发酵提取液对3种细菌的抑菌圈直径均最大，结合对于3种细菌的抑菌圈直径分析，发酵液对于3种菌的抑菌性高于多肽提取液，对金黄色葡萄链球菌的抑制低于大肠埃希菌与马拉色菌。

2.4 发用功效评价

2.4.1 光泽度分析结果 如图7所示，经不同提取液处理的发丝较对照组相比，光泽度变化值提升均具有显著差异（P＜0.001），具有改善发束光泽度的效果。发酵液较低于葡聚糖提取物与多肽提取物，或因葡聚糖提取物与多肽提取物中含较大分子量的燕麦蛋白，可附着于发丝表面，改善发丝光泽度与柔顺度。

图7 不同提取液浸渍发丝光泽度变化Fig.7 Changes in the glossiness of hair soaked with different extract

2.4.2 干梳理性改善效果分析 通过图8头发多功能测试系统分析结果可以看出，葡聚糖提取液、多肽提取液与发酵液的干梳理功（图8-A）和干梳理最大载荷（图8-B）小于对照组且结果均具有显著差异，表示测试样品具有改善发束干梳梳理、减少打结的效果。3组之间干梳理最大载荷和干梳理功差异不显著。

图8 不同提取液浸渍发丝干梳理功（A）与干梳理最大负荷（B）Fig.8 Dry carding work（A）and maximum load（B）of dry carding for hair soaked with different extract

2.4.3 α-角蛋白还原能力分析 头发α-角蛋白DSC曲线在230-250℃有一个被标记为α-螺旋峰的吸热峰，峰值温度（Td）被定义为α-螺旋峰的变性温度；峰的面积（△Hd）表示为变性焓，指的是α-螺旋峰变性所需的能量（每克干发吸收的热量），△Hd用于计算相对螺旋含量，峰面积越小，α-角蛋白受损程度越大。如图9所示，经葡聚糖提取液、多肽提取液与发酵液处理的发丝的α-螺旋峰的变性温度较对照组均有提升，RHC分别为95.04%、86.02%、100.01%，相比于对照组均体现出对α-角蛋白的还原能力，对受损发质起到修复作用，其中燕麦麸皮发酵液修复力最显著。

图9 不同提取液浸渍发丝相对螺旋含量Fig.9 Relative helix content of hair soaked with different extract

2.4.4 毛鳞片修复能力分析 SEM 是应用电子束在样品表面扫描激发二次电子成像的电子显微技术。由于它的高分辨率，运用其对头发表面的形貌进行分析，可以直观检测头发受损程度。

通过电镜扫描图片分析可以看出，对照组（图10-A）经水洗处理，观察到以下形态学变化：毛鳞片的边缘轻微锯齿状，可见裂缝，有角质脱落的现象。图10-B-D显示，3种提取液处理发丝后，头发具有完整、紧密重叠的毛鳞片层，能够清晰地分辨毛鳞片的形状和方向，毛鳞片外翻有不同程度减轻，无局部剥落。3组测试样品对损伤发束的毛鳞片（毛鳞片闭合程度）有修护效果，发酵液组毛鳞片边缘闭合程度最高，对毛鳞片闭合效果最显著。

图10 经蒸馏水（A）、葡聚糖提取液（B）、多肽提取液（C）和发酵液（D）浸提发丝的扫描电镜图Fig.10 SEM images of hairs soaked with distilled water（A）, glucan extract（B）, peptide extract（C）and fermentation extract（D）

3 讨论

3.1 菌种与接种比例的选取

试验选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌联用发酵。单一的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌产生的蛋白酶均可以将不可溶蛋白分解成肽，改变其营养结构，提高蛋白质的利用效率，将这两种菌的发酵程度结合在一起，既能充分降解麸皮中的蛋白质，又能维持在一定的碳源、氮源消耗。酵母可提升谷物类发酵液澄清度和气味等方面的感官品质［17］，并帮助燕麦麸皮细胞破壁，提高β-葡聚糖提取率。实验需要考虑酵母β-葡聚糖的影响，酵母菌细胞壁中同样存在的β-葡聚糖也可通过刚果红法进行检测。但酵母菌不易破壁，且酵母β-葡聚糖一般条件下不易溶于水，酵母β-葡聚糖溶出至发酵液中的可能性较低。为排除酵母β-葡聚糖的干扰进行了两组对照实验，一组以酵母膏胨葡萄糖培养基单独培养酵母菌，另一组将燕麦麸皮换为营养成分类似但β-葡聚糖含量低的绿豆，以相同工艺条件接入枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌与酵母菌制备绿豆发酵液，经高温灭菌后的两组通过刚果红法均未检出β-葡聚糖，判断该发酵工艺流程不能溶出酵母菌细胞壁中的β-葡聚糖，即所得燕麦麸皮发酵液中β-葡聚糖均来自燕麦。

混合发酵过程较为复杂，通过最终产物得率不能全面掌握菌种生长状况。为获得菌种联用更好的发酵效果，需了解不同比例接种条件下，在发酵过程中各时段的不同菌种的活菌数以评价生长情况，并以此确定最低的发酵时间。酵母菌的生长周期比枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌长，且生长稳定，因此试验中固定酵母菌接种量，以（枯草芽孢杆菌＋地衣芽孢杆菌）∶酵母菌=2∶1 的比例进行实验，最终确定3个菌种的接种比例。菌种比例确定的实验中发现，初期枯草芽孢杆菌数量快速上升时，蛋白酶降解形成的多肽具有一定的抑菌性，因此枯草芽孢杆菌生长受到抑制，但随着多肽进一步降解为更小分子小肽，抑菌作用有所减弱，枯草芽孢杆菌出现第二次生长。另外，地衣芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌的生长存在一定的拮抗［18］，提升地衣芽孢杆菌的接种比例时，枯草芽孢杆菌数量被持续抑制。

3.2 发酵工艺优化结果分析

目前对于发酵提取工艺条件的优化大多数采用单因素实验结合正交试验，可以快速准确地得到优化条件。实验通过优化料液比、发酵时间、发酵温度、接种量，发酵提取燕麦多肽与燕麦β-葡聚糖得率分别达到16.21%和5.98%。通过正交试验结果可知，料液比的影响最为明显，料液比是影响细胞内外渗透压的主要因素，适当料液比利于活性成分溶出［19］，又能节约溶剂［20］。其次为接种量，接种量对发酵过程中各菌种的数量和生长状况有较大影响，当液体发酵培养基固定的情况下，接种量过高会使培养基总营养物质不足导致接入的菌种生长代谢受到很大的限制，对发酵过程中的促进作用减弱［21］。

将发酵法与热提取β-葡聚糖、酶解提取燕麦多肽工艺对比，根据统计学分析，发酵提取法单一的燕麦多肽与燕麦β-葡聚糖的得率与热提取葡聚糖和酶解提取燕麦多肽相比无显著差异，但考虑燕麦β-葡聚糖和燕麦多肽综合得率，发酵提取分别比热提取和酶解提取得率提高195.7%和35.81%。

3.3 发酵过程对活性的影响

多菌种联用发酵可同时提取燕麦多肽与燕麦β-葡聚糖，且发酵过程提高了燕麦麸皮提取物的抗氧化活性。燕麦多肽可通过清除自由基、减少脂肪过氧化氢含量和螯合金属离子来发挥其抗氧化活性［22］；燕麦β-葡聚糖因其具有较强的吸附小分子的能力，能和多酚通过氢键、疏水相互作用等结合，形成的多糖多酚复合物能为机体提供更持久的抗氧化能力［6］，同时还能增加谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活的活性，减少脂质过氧化［23-24］。发酵过程通过破坏燕麦麸皮细胞壁，释放多酚类物质［25］，与β-葡聚糖结合，相比单独的β-葡聚糖、多肽提取液，表现出更好的抗氧化性。

通过抑菌活性实验了解到，发酵液对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与马拉色菌的抑制作用均显著优于多肽提取液。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌是皮肤感染中最常见的病原菌［26］。马拉色菌是引起头屑问题的主要菌种［27］，抑制马拉色菌是目前减少头屑问题的主要方法。葡聚糖提取液中含有少量蛋白，但未经水解不具备抑菌活性。一方面发酵过程对抑菌肽活性具有一定促进作用，另一方面酵母发酵帮助释放燕麦麸皮中的多酚类物质，也起到了一定的抑菌作用［28］。

燕麦中的功能成分常应用到护发类化妆品中［29］。实验对发酵液进行发用功效评价，发用功效评价较多采用离体真人发丝模拟的方法，通过对头发纤维的形貌、结构、化学成分和机械性能等的改变对功效进行量化评估［30］。通过实验了解到，相比于葡聚糖提取液和多肽提取液，发酵液还原α-角蛋白，闭合毛鳞片的效果更为显著，或源于发酵过程降低了葡聚糖与多肽的分子量，更利于发丝对于功效成分的吸收，而大分子聚合物更有利于提升发丝的光滑度与光泽度［31］。

此工艺制得的燕麦麸皮发酵液在护发方面具有较好的开发应用前景，但试验仅研究了原料提取液和发酵液的一些生化指标和对比功效评价，可将本文所得到的提取工艺与其他仪器分析方法相联合，对原料中的有效成分进行分离、纯化及结构鉴定，对比分析是否通过微生物的作用产生了新的活性物质，研究其发酵后功效增强的原因以及作用机理，以达到综合开发利用的目的。

4 结论

使用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌联用发酵燕麦麸皮可同时提取燕麦β-葡聚糖与燕麦多肽，最佳工艺条件为料液比1∶7.5、温度30℃、接种量2%、发酵时间42 h。发酵液可有效清除DPPH、ABTS和羟自由基，具有抗氧化能力；对大肠埃希菌、金黄色葡萄链球菌和马拉色菌有抑制效果；具有一定护发效果，在修护毛鳞片与α-角蛋白还原方面更显著，为采用发酵工艺制备燕麦麸皮提取液在护发方面的应用提供参考。