侯闻闻，余良政，樊毛迪，朱振邦，林成贤，陈昌海，李向东*

(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；3. 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009；4. 金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司，福建 厦门 361028；5. 江苏省动物疫病预防控制中心，江苏 南京 210036)

猪腹泻病是一类在临床上十分普遍的疾病，其对仔猪造成的影响较大[1]，给全世界的养猪业造成了巨大损失。临床上引起猪腹泻常见的病毒性病原主要包括：猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)等[2-4]。PEDV属于冠状病毒科、α冠状病毒属，是一种单股正链 RNA 病毒[5]。自2010年以来，PEDV出现了新型变异毒株，在多个国家大规模暴发[6]。TGEV属于冠状病毒科、α冠状病毒属[7]，我国最早于1956年在广东省发现TGEV，近年来，我国大部分省市均有该病的流行，且发病率呈上升趋势[8]。PoRV属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，在世界范围内广泛存在[9]，我国于1981年报道首次分离到PoRV，目前在全国范围内流行[10]。PDCoV属于冠状病毒科、δ冠状病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒[11]，近年来在我国各地猪场广泛存在[12]。这4种病原引起的症状十分相似，都表现为腹泻、脱水，体重减轻等，在临床上需要加以鉴别诊断。现有对上述4种猪腹泻病毒的检测方法包括传统的RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR等，但上述方法操作较为复杂，操作人员要经过专业培训，不能用于现场操作，且耗时较长，在突发疫情时不能进行快速诊断以达到及时扑灭疫情的目的。新型恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)检测方法，利用Rayleigh-Bernard自然对流原理，通过底部的单一热源进行加热，使得R-tube底部的温度能够维持在95 ℃，而R-tube上部的温度处于自然冷却状态，上下的温度差形成自然的热对流，形成可供PCR扩增反应的连续温度梯度[13]。这种自然对流促进了反应液的自发循环，扩增效率高，可在42 min内完成检测。该检测方法借助于POCKITTMMicro Duo手持式核酸分析仪，仪器重量仅为430 g，电源为锂电池，可充电使用，并且检测结果以“+”(阳性)、“-”(阴性)和“？”(可疑)的形式直接显示，便于非专业人员读取结果，给现场检测带来了极大的便利。本研究拟开发针对上述4种病毒性腹泻病原的iiRT-PCR方法，用于临床现场快速检测。

1 材料与方法

1.1 病毒与临床样品

TGEV、PEDV、PoRV(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)购自哈尔滨维科生物技术有限公司；PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV)保存于本实验室；临床样品来自于江苏省某猪场。

1.2 主要试剂

rTaq酶购自TaKaRa公司；DL2000 Plus DNA Marker购自诺唯赞生物科技有限公司；Uni-iiPCR Starter Kit购自中国台湾瑞基海洋生物科技公司。

1.3 主要仪器

POCKITTMMicro Duo手持式核酸分析仪购自中国台湾瑞基海洋生物科技公司；荧光定量PCR仪购自Thermo Fisher Scientific；电泳仪和凝胶成像仪均购自上海天能科技有限公司。

1.4 引物和探针的合成

下载NCBI GenBank中PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV毒株基因组序列至少各20条进行比对与分析，并选择最保守的PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因区域设计引物和探针(表1)，引物和探针由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 4种猪腹泻病毒iiRT-PCR引物与探针信息

1.5 核酸提取

用TRIzol法提取TGEV、PEDV、PoRV、PDCoV、CSFV、PRRSV、JEV的RNA，将上述病毒的RNA反转录为cDNA，于-20 ℃保存备用。

1.6 反应体系优化

按Uni-iiPCR Starter Kit说明书的建议对反应体系进行优化。反应总体系为50 μL，用方阵法分别对上下游引物浓度10 μmol/L(1.25～5 μL)、探针浓度10 μmol/L(0.25～2.5 μL)，Taq聚合酶5 U/μL(1～5 μL)、反转录酶20 U/μL(0.5～2 μL)进行优化。

1.7 特异性评价

以PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、CSFV、PRRSV、JEV的RNA为模板，以Nuclease-free水为阴性对照，按照1.6中确立的最佳反应条件，分别用PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的4对引物对上述模板和阴性对照进行iiRT-PCR检测，并使用2%琼脂糖凝胶对iiRT-PCR产物进行电泳，阳性扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序，以评价4种病毒的引物特异性。

1.8 敏感性评价

将PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV的RNA进行10倍倍比稀释至10-5作为模板，以Nuclease-free H2O为模板作为阴性对照，用建立的iiRT-PCR方法进行检测，测定该方法的检测下限。将PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV的cDNA按10倍倍比稀释至10-5作为模板，Nuclease-free H2O为模板作为阴性对照，用相同引物和探针分别建立4种猪腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法，检测荧光定量RT-PCR方法的下限，并将2种方法得到的检测下限对比，以评价iiRT-PCR方法的敏感性。

1.9 稳定性评价

采用建立的iiRT-PCR方法分别对4种腹泻病毒的5个稀释度(10-1～10-5倍稀释)的RNA进行检测，每种浓度的RNA模板重复检测3次，检测其批内重复性；另外，以这些RNA为模板在不同时间进行3次独立检测，每次间隔1 d，检测其批间重复性。

1.10 临床样品的检测

对采自江苏省不同猪场的22份腹泻临床样品，分别用本研究建立的iiRT-PCR方法和荧光定量RT-PCR方法进行检测，比较2种方法检测结果的符合率。

2 结果

2.1 反应体系优化

分别对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV 4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法的引物、探针、Taq聚合酶、反转录酶进行优化，确定最佳反应体系为50 μL：Uni-ii Buffer(2×)为25 μL，上、下游引物均为5 μL(终浓度均为1 μmol/L)，探针0.25 μL(终浓度为0.05 μmol/L)，Taq聚合酶1 μL(终浓度为0.1 U/μL)，MMLV反转录酶1.25 μL(终浓度为0.5 U/μL)，Nuclease-free H2O为10.5 μL，RNA模板为2 μL。

2.2 特异性试验

用本研究建立的4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法分别对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV阳性样品进行检测，同时对其他常见猪病毒性病原包括PRRSV、CSFV、JEV进行检测，并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的引物和探针分别特异性地扩增PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV阳性样品，而无法扩增其他无关病原和阴性对照，其阳性扩增产物片段分别在83、89、91、99 bp(图1)，符合预期大小。对阳性扩增产物测序结果进行分析证实检测无误，说明该方法特异性强。

A. PEDV iiRT-PCR方法特异性验证，其中：M. Marker，P. PEDV(阳性对照)，N. Nuclease-free H2O(阴性对照)，1～6. 依次为TGEV、PoRV、PDCoV、PRRSV、CSFV、JEV；

2.3 敏感性试验

分别将商品化PEDV、TGEV、PoRV三联弱毒疫苗(105TCID50/mL)和实验室保存的PDCoV(106TCID50/mL)提取的RNA进行10倍倍比稀释(10-1～10-5)，并以此为模板，用建立的iiRT-PCR方法进行检测，结果显示4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法检测下限分别为102、102、103、103TCID50/mL。

建立的荧光定量RT-PCR方法的反应体系为：rTaq酶10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.2 μL，10 μmol/L探针0.2 μL，模板2 μL，使用Nuclease-free H2O补足至20 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，同时收集荧光信号。Ct≤35时判定为阳性样品。其检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV cDNA下限分别为101、102、102、102TCID50/mL。

2种方法检测结果显示iiRT-PCR方法检测的敏感度略低于荧光定量RT-PCR方法(图2)。

1～5. 依次为10-1～10-5倍稀释；6. 阴性对照。

2.4 重复性试验

采用建立的iiRT-PCR方法对2.3中使用的病毒5个稀释度进行批内和批间重复性试验，结果表明批内3个平行和批间3次重复试验结果完全一致，证明建立的方法具有良好的重复性。

2.5 临床样品的检测情况

本研究建立的iiRT-PCR方法与荧光定量RT-PCR方法检测临床样品的结果一致，检测的22份临床腹泻样品中，PEDV阳性样品9份(阳性率为 40.91%)、TGEV阳性样品2份(阳性率为 9.09%)、PoRV阳性样品10份(阳性率为45.45%)、PDCoV阳性样品为2份(阳性率为 9.09%)。其中，PEDV与PoRV混合感染阳性样品4份(18.18%)，PDCoV与PoRV混合感染阳性样品1份(4.55%)。2种方法检测结果符合率为100%，表明本研究中建立的iiRT-PCR方法准确可靠。

3 讨论

由PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV 4种猪腹泻病毒引起的临床表现十分相似，仔猪大都表现为腹泻、呕吐、脱水等，仅通过临床症状和病理剖检难以区分这些病毒引起的疾病。目前已有建立这4种病毒的多重RT-PCR及多重荧光定量RT-PCR方法的报道[14-16]，也有PEDV等病毒单重iiRT-PCR方法建立的报道[17-18]。而本研究首次从腹泻症候群角度建立针对这4种病原的iiRT-PCR方法，通过一次iiRT-PCR检测即可诊断是由上述4种病原中的哪种病毒引起的腹泻。

传统的普通PCR方法和实时荧光定量PCR方法需要专门的实验室设备，操作步骤较为繁琐，且检测耗时较长，无法实现现场检测。而iiPCR的仪器重量轻，体积小，便于携带，并且操作简单，检测速度快，结果直接，无需进行琼脂糖凝胶电泳，从而避免了交叉污染。目前国内外已有针对严重急性呼吸综合征冠状病毒、黄热病毒、登革热病毒、非洲猪瘟病毒等iiPCR方法建立的报道[19-21]。本研究针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计了特异性的引物和探针，经优化反应条件后，建立了针对这4种猪腹泻病原的iiRT-PCR方法，通过试验验证了该方法的特异性、敏感性和重复性。但同时需要注意的是，该方法也存在一定的不足之处，如：iiPCR需要专门的试剂和R-tube管，检测成本与普通PCR和荧光定量PCR相比较高。iiPCR检测更适合由DNA病毒引起的重大动物疫病，如非洲猪瘟的现场快速诊断和拔牙式清除[20]。

对于猪腹泻病毒混合感染的报道很多。施开创等[14]检测的广西省243份临床腹泻样品中，PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV混合感染阳性样品8份(3.29%)；丁庆文等[22]检测的92份猪腹泻样品中，PEDV与PDCoV混合感染率为20.65%；许梦怡等[23]检测的40份腹泻猪病料中，TGEV 与 PEDV 混合感染率为2.5%，PEDV 与 PoRV 混合感染率为5%。本研究对22份猪腹泻临床样品进行检测，也发现了有混合感染的情况存在，其中PEDV与PoRV混合感染阳性样品4份(18.18%)，PDCoV与PoRV混合感染阳性样品1份(4.55%)，说明临床上猪腹泻病毒混合感染的情况十分普遍，这也给腹泻疾病的诊断和防控造成一定的困难，应该引起重视。