张 也， 马 亮， 李亚蕾， 王松磊

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

亚硝酸盐是指含有亚硝酸根阴离子（NO2-）的一类盐，被用作食品添加剂广泛应用于腌制肉类罐头及肉制品中，具有护色、增进风味和防腐等作用[1-3]。人体摄入过量亚硝酸盐，可使血红蛋白转化为高铁血红蛋白，失去携氧能力造成机体缺氧[2，4-5]。 此外，亚硝酸盐还可与体内的胺类结合成具有致癌作用的亚硝胺，严重危害人体健康[1，4]。 因此，建立准确、快速检测食品中亚硝酸盐的方法具有重要的研究意义。

检测食品中亚硝酸盐的方法主要有分光光度法[6-8]、离子色谱法[9-11]、毛细管电泳法[12]、荧光光谱法[13-14]和电化学法[5，15-17]等。 对比传统方法，电化学方法具有操作简单、 响应迅速和灵敏度较高等优点，在亚硝酸盐检测中具有广阔的应用前景[18]。 电化学传感器的原理是电极敏感材料与目标物的相互作用和识别，对电极进行纳米材料的修饰，从而降低电极电势，提高电极催化性能，实现对待测物的准确和灵敏测定[2-3，19]。

过渡金属氧化物（如氧化铜[20-21]、氧化钴[22]和氧化镍[23]等）由于成本低、来源广和催化性出色等优点已经受到广泛关注。 各种钴基催化剂被发现具有类似酶催化作用，其中钴氧化物被研究最多，与生物酶相比具备许多优势，如不易失活、成本低廉、易保存、催化性能稳定等[24]。 泡沫镍因具有三维立体结构、大的表面积、低成本、优良导电性等优点而常被用作支撑材料[25-26]，通过水热合成法可以在金属泡沫镍上生长出纳米材料，从而用于构建电化学传感器。

通过水热合成法在泡沫镍上生成钴基氢氧化物前驱体，然后将其放置管式炉中于空气中高温煅烧，制备泡沫镍基负载Co3O4纳米复合材料，构建电化学传感器，用于食品中亚硝酸盐的检测。 通过电化学工作站研究该传感器的电催化机理和电化学性能，表明该修饰电极对亚硝酸盐的检测具有大的检测范围和高灵敏度。 并进行了实际样品检测，所得结果与国家标准中方法检测结果基本一致，表明该传感器可用于快速检测食品中的亚硝酸盐。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硝酸钴（Co（NO3）2·6H2O）、氟化铵（NH4F）、脲（尿素，CH4N2O）、无水乙醇、丙酮、 铁氰化钾、亚铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、亚硝酸钠、浓盐酸等（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；泡沫镍：天津艾维信化工科技有限公司产品；实验中清洗、配制溶液等均使用超纯水。

1.2 仪器与设备

CHI660E 电化学工作站、饱和甘汞电极、铂丝电极：上海辰华仪器有限公司产品；电热真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司产品；管式炉：合肥科晶技术有限公司产品；电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；超声波清洗器：深圳洁盟清洗设备有限公司产品；磁力搅拌器：上海弗鲁克仪器有限公司产品；微量移液器：赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 电化学传感器制备 泡沫镍预处理[27]：用剪刀将泡沫镍裁剪为1.0 cm×1.0 cm 的薄块， 置于3 mol/L 盐酸溶液中超声浸泡30 min， 然后依次用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗8 min，以便除去泡沫镍表面的油污和氧化层等杂质，最后将清洗后的泡沫镍片放入电热真空干燥箱中， 于60 ℃下真空干燥6 h 备用。

水热合成法制备钴基氢氧化物/泡沫镍[24]：分别称取2 mmol 的Co（NO3）2·6H2O、8 mmol 的NH4F、1 mmol 的CH4N2O 溶于40 mL 超纯水中，用磁力搅拌器以5 000 r/min 搅拌10 min 至为均匀溶液。 然后将上述处理好的泡沫镍和混合溶液转移至100 mL的水热反应釜中， 置于电热真空干燥箱中于120 ℃条件下反应10 h，待反应结束后使反应釜自然冷却至室温，然后用镊子取出泡沫镍，用超纯水冲洗表面2～3 次， 再置于电热真空干燥箱中于60 ℃下真空干燥6 h。

钴基氢氧化物/泡沫镍转变为Co3O4/Ni foam[24]：将干燥后的钴基氢氧化物/泡沫镍置于瓷舟中，再将瓷舟放入管式炉的石英管升温区中心， 以5 ℃/min的升温速率升温至350 ℃，并在空气的氛围下煅烧2 h，自然冷却至室温得到Co3O4/Ni foam。

Co3O4/Ni foam 的制备流程如图1 所示。

图1 Co3O4/Ni foam 电极的制备过程Fig. 1 Preparation process of Co3O4/Ni foam nanomaterials

1.3.2 电化学检测

所有电化学测量均在CHI660E 电化学工作站上进行，将制备的Co3O4/Ni foam 纳米复合材料用作工作电极，铂丝电极用作对电极，饱和甘汞电极用作参比电极。 在室温下进行检测，以0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS 缓冲液，pH 6.0）作为电解液，实验前需通氮气除去溶液中的氧气。 采用循环伏安法分别设置不同的扫描速率（50、100、150、200、250、300 mV/s）， 扫描电压0～1.2 V， 研究NO2-在Co3O4/Ni foam 表面的电化学行为。 采用计时安培滴定法研究电化学传感器的亚硝酸根（NO2-） 检测范围及检测限，外加电压为0.83 V。

1.4 数据统计

采用Origin、Digital Micrograph、Jade 等软件对实验数据进行分析以及图形处理。

2 结果与分析

2.1 修饰电极材料的形貌表征

通过扫描电子显微镜（SEM）和高分辨透射电子显微镜（HRTEM）对Co3O4/Ni foam 纳米复合材料的形貌进行了表征。 如图2（a）所示，未生长金属氧化物的泡沫镍骨架表面平滑，可为纳米材料生长提供大的表面。由图2（c）中可以看到在金属泡沫镍架构上均匀地嵌插生长着许多梭状颗粒；进一步放大观察倍数后（如图2（e）所示)，可以看到Co3O4纳米颗粒均匀地嵌插在泡沫镍架构上， 由3～5 μm 的针状团簇组成。 这种特殊的结构能够使材料充分接触电解液，从而提高电子传输性能，利于电解液的渗透，使得催化剂能够与电解质有更多更大的接触面积，能够为催化反应提供更多的反应活性位点，有利于提高电催化性能。 结合HRTEM 图可以清晰地观察到晶格条纹，用Digital Micrograph 软件测量晶格间距为0.224 nm，对应立方晶相Co3O4的（311）晶面间距，与现有的研究结果一致[24]，表明成功地合成了Co3O4/Ni foam 纳米复合材料。

2.2 Co3O4/Ni foam 电极对亚硝酸盐的电化学行为

电化学阻抗谱 （electrochemical impedance spectroscopy，EIS）法可以表征电极材料的电子传递电阻，阻抗图的直线部分表示电子转移过程受扩散控制，半圆部分表示受动力学控制，圆弧半径越大表明材料对电子阻碍作用越大[28]。 Ni foam 电极和Co3O4/Ni foam 电极在含0.1 mol/L KCl 的5 mmol/L Fe（CN）6）3-/4-溶液中的电化学阻抗谱图如图3 所示，设置电化学工作站参数，频率在0.01～100.00 Hz，频率数为50，振幅为0.2 V。从图3 中可以看出，与Ni foam 电极相比，Co3O4/Ni foam 电极的半圆部分明显减小， 表明Co3O4/Ni foam 纳米复合材料导电性较好，利于电子传递，因此合成的Co3O4/Ni foam 具有良好的导电性，表明该纳米复合材料适用于制备传感器。

图3 Ni foam 电极和Co3O4/Ni foam 电极的电化学阻抗谱图Fig. 3 Electrochemical impedance spectra of Ni foam electrodes and Co3O4/Ni foam electrodes

以0.1 mol/L、pH 6.0 的磷酸盐缓冲液 （PBS 缓冲液）为电解液，加入2 mmol/L NaNO2溶液，测得Ni foam 电极和Co3O4/Ni foam 电极的循环伏安曲线如图4 所示。 在0～1.2 V 时，Ni foam 电极和Co3O4/Ni foam 电极在空白缓冲液中都没有氧化峰。 当NO2-存在时，Ni foam 电极没有明显响应，Co3O4/Ni foam 电极在0.83 V 处有一个明显的氧化峰，峰电流为480 μA，且反向扫描无还原峰出现，表明NO2-在电解液中发生了不可逆的氧化还原反应，从而表明Co3O4/Ni foam 对亚硝酸盐的氧化具有良好的催化能力，能够增强电极的信号强度，有助于提高检测的灵敏度， 对亚硝酸盐的检测有良好的电化学响应。NO2-失去电子被氧化成NO3-，引起电流增大，形成电信号，从而被电化学工作站检测到，NO2-的电化学电解的机理[29-30]如下：

图4 Ni foam 电极和Co3O4/Ni foam 电极在不同缓冲液中的循环伏安曲线Fig. 4 Cyclical voltammetry of Ni foam and Co3O4/Ni foam in different solutions

2.3 扫描速率对Co3O4/Ni foam 电化学性能的影响

采用循环伏安法（CV）研究扫描速率（50、100、150、200、250、300 mV/s）对Co3O4/Ni foam 电催化氧化NO2-的影响，结果如图5 所示，随着扫描速率的增加， 氧化峰的峰电流逐渐增加， 在50～300 mV/s时，峰电流与扫描速率的平方根（V1/2）呈良好的线性关系， 所对应的线性方程为y=3.990+0.102x （R2=0.998）， 说明NO2-在电极表面的电化学氧化反应是受扩散控制的电子转移过程。

图5 不同扫描速率对Co3O4/Ni foam 电催化氧化NO2-的影响Fig. 5 Effect of different scanning rates on the catelytic oxidation of NO2-by Co3O4/Ni foam

2.4 电解液pH 对Co3O4/Ni foam 电化学性能的影响

亚硝酸盐的电化学氧化反应过程中有氢离子（H+）参与，溶液的pH 是氢离子物质的量浓度的负对数， 因此溶液的pH 对亚硝酸盐的测定有重要影响。 缓冲液pH 对电极检测NO2-的氧化峰电流的影响如图6 所示， 在pH 从5.0 增加到6.0 过程中，氧化峰电流逐渐增大，这可能是由于亚硝酸钠在酸性条件下易于分解成NO 和NO3-[5]。 当pH 为6.0～8.0时，氧化峰电流逐渐减小，这可能是由于伴随pH 逐渐增大，氢质子不断减少，导致电催化氧化NO2-变得相对困难，电信号减小。 因此，本实验选用pH 6.0作为后续研究的最优pH。

图6 缓冲液pH 对亚硝酸盐循环伏安响应的影响Fig. 6 Effect of buffer pH on cyclic voltammetry response of nitrite

2.5 Co3O4/Ni foam 的工作曲线和检测限

采用计时安培滴定法对不同浓度NaNO2进行测定，结果如图7 所示。在磁力搅拌器均匀搅拌下，恒电压为0.83 V，100 s 为间隔连续向0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0） 中滴加10 μL 不同浓度的NaNO2溶液， 得到电流-时间曲线和峰电流与NO2-浓度的线性关系图。 从图7（a）中可以明显看出，当向PBS 缓冲液中滴加了一定量的NaNO2时，响应电流迅速上升并在3 s 左右达到稳定电流值， 表明该传感器对NO2-响应灵敏。随着NaNO2浓度的不断增加，响应电流逐渐增大，在NO2-浓度5～2 100 μmol/L时，呈良好的线性关系，线性拟合方程分别为y=6.29+0.001 42x（R2=0.998），y=4.59+0.007 21x（R2=0.999），Co3O4/Ni foam 对NO2-的检测限为3.14 μmol/L，低于已报道与泡沫镍相关的修饰电极的NO2-电化学传感器[31-32]，说明制备用于检测NaNO2的Co3O4/Ni foam 传感器具有灵敏度高、检测限低、线性范围宽的优点。

图7 Co3O4/Ni foam 在0.1 mol/L PBS（ pH 6.0） 缓冲液中对不同浓度的亚硝酸盐的计时电流响应Fig. 7 Chronoamperometry response of Co3O4/Ni foam to nitrite of different concentrations in 0.1 mol /L PBS solution(pH 6.0)

2.6 电极的选择性和稳定性研究

为了研究Co3O4/Ni foam 电极对NO2-的选择性和抗干扰性，选择食品中常见存在的离子（包括K+、Na+、NO3-、S2-、Cl-、CO32-、苯甲酸根、山梨酸根）作为干扰物质代表，干扰离子浓度为0.2 mol/L（NO2-浓度的100 倍）。 在磁力搅拌器均匀搅拌的条件下，分别取上述离子加入到2 mmol/L NaNO2溶液中，通过计时安培滴定法获得电流-时间曲线， 从图8 中可以明显看出NO2-的氧化峰电流没有明显变化，是因为制备的Co3O4/Ni foam 电极对NO2-具有特异性，当干扰离子存在时只对NO2-有催化氧化的作用，表明该传感器有良好的选择性，可用于实际样品的检测。

图8 Co3O4/Ni foam 在不同离子存在下对2 mmol/L NO2-检测的计时电流响应Fig. 8 Chronoamperometry response of Co3O4/Ni foam to 2 mmol/L NO2- detection in the presence of different ions

为了考察Co3O4/Ni foam 电极的稳定性，在含有2 mmol/L NaNO2的0.1 mol/L PBS 缓冲液中连续循环扫描30 圈，氧化峰电流基本不变，说明该传感器稳定性好。 将制备的Co3O4/Ni foam 电极放置于自封袋中，在室温、干燥的条件下保存，并使用该Co3O4/Ni foam 电极作为工作电极，对NO2-进行检测，连续记录每天获得的循环伏安曲线，20 d 后电流信号为最初响应电流信号的96.5%（见图9），表明Co3O4/Ni foam 电极长期储藏后也是稳定的。 以上结果表明Co3O4/Ni foam 电极具有良好的稳定性。

图9 连续记录存放20 d 的Co3O4/Ni foam 在含有2 mmol/L NO2-的缓冲液中的循环伏安曲线Fig. 9 Continuous record of the cyclic voltammetry curves of Co3O4/Ni foam stored for 20 days in buffer solution containing 2 mmol/L NO2-

2.7 对实际样品的检测

购买酱牛肉作为待测样品， 进行加标回收检测。各取2 g 上述样品捣碎置于50 mL 离心管中，加入25 mL 缓冲液， 涡旋振荡混匀2 min， 再超声10 min， 保证固相分散均匀， 加入硫酸锌使蛋白质沉淀，然后置于75 ℃水浴20 min，取出冷却至室温过滤，保留滤液待用，然后加入亚硝酸盐标准品进行3次平行检测（n=3）。 Co3O4/Ni foam 传感器检测滤液中亚硝酸盐质量分数为18.8 mg/kg， 低于国家标准GB 2760—2014 规定的最大残留量30 mg/kg， 如表1 所示， 根据研究结果计算可得相对标准偏差（RSD） 为3.82%～4.74%， 加标回收率为97.9%～101.2%。 研究结果表明，基于Co3O4/Ni foam 构建亚硝酸盐电化学传感器成功应用于实际食品中亚硝酸盐的检测。采用国家标准GB 5009.33—2016 规定的分光光度法（盐酸萘乙二胺法）测得样品中的亚硝酸盐含量[33]，两种方法的检测结果基本一致，验证了实验结果的准确性，说明基于Co3O4/Ni foam 构建的电化学传感器用于检测肉制品亚硝酸盐具有准确性好和稳定性高的优点。

表1 Co3O4/Ni foam 电极对酱牛肉中亚硝酸盐的检测Table 1 Detection of nitrite in soy sauce beef with Co3O4/Ni foam electrode

3 结 语

通过水热合成法和高温煅烧法成功地制备了泡沫镍基负载Co3O4纳米复合材料， 构建高灵敏度亚硝酸盐电化学传感器。利用SEM 和HRTEM 对材料的结构和形貌进行表征， 发现Co3O4纳米颗粒呈针状均匀覆盖在泡沫镍上，能够加快反应时的电子传输速率，增强电化学信号。 通过循环伏安法、计时安培滴定法等电化学方法研究了Co3O4/Ni foam 传感器对NO2-检测性能。 Co3O4与泡沫镍有协同作用，能提高对NO2-电催化活性，同时提高电信号传输速率，传感器的线性响应范围为5～2 100 μmol/L，最低检测限为3.14 μmol/L，该修饰电极制备的亚硝酸盐电化学传感器具有灵敏度高、选择性好、稳定性高和可以长期存放等优点，可用于肉制品中亚硝酸盐快速检测。 本研究中基于三维多孔材料与过渡金属氧化物结合制备的Co3O4/Ni foam 传感器，为食品中亚硝酸盐的快速检测提供了新思路。