单晨，张超，张传宝

·综述·

亲和标签在重组蛋白纯化领域的应用与进展

单晨，张超，张传宝

100730 北京，北京医院/国家老年医学中心/国家卫生健康委临床检验中心/中国医学科学院老年医学研究院/中国医学科学院北京协和医学院

近年来，随着生物制药、体外诊断和一些新兴技术领域的快速发展，高纯度、高活性蛋白的需求量也在不断增加，但由于蛋白质本身的复杂性与现有技术的局限性，大规模回收和纯化目的蛋白仍然面临很大挑战。

目前，利用亲和标签来辅助蛋白质纯化是学术研究和工业生产的首选方法，借助合适的标签设计可以为最终的蛋白产物提供足够高的纯度和产量，同时保留其固有的结构和功能，大大节省了蛋白质生产过程中的时间和成本。但由于不同的亲和标签各有其优点和局限性，因此常常需要根据所表达蛋白的特点进行合理的选择。此外，随着生物信息学和材料科学的飞速发展，研究人员不仅对现有标签纯化系统进行了优化，还开发了一系列更高效的新型纯化方案，大大推动了重组蛋白纯化技术的进步。

1 亲和标签的特征及应用

亲和标签是对特定配体具有高度亲和力的外源性氨基酸序列，可以通过重组 DNA 技术融合到目标蛋白的末端，在重组蛋白的纯化过程中有着重要作用。根据分子量大小，亲和标签可以分为小分子量的短肽标签和大分子量的蛋白标签（表1）。其中，短肽标签一般不会对目的蛋白的结构和功能造成影响，在大部分情况下不需要进行切除；而蛋白标签除了由于自身分子量较大需要进行切除之外，同时也具备增加目标蛋白溶解度的优点。因此，在重组蛋白表达和纯化过程中，我们需要根据所表达蛋白及下游应用的不同选择合适的亲和标签。

1.1 短肽标签

1.1.1 传统短肽标签 His 标签是重组蛋白纯化过程中最常用的亲和标签，一般由 6 个或 6 个以上连续的组氨酸残基组成。该标签体积小，免疫原性低，通常不会影响融合蛋白的结构或功能[10]。基于组氨酸残基与金属离子（如 Ni2+、Cu2+、Zn2+等）之间的螯合作用，固定化金属亲和层析（immobilized metal-ion affinity chromatography，IMAC）技术已成为 His 标记蛋白分离纯化的首选方法[1]。简单来说，IMAC 技术可以通过结合、洗涤、洗脱三个步骤实现目标蛋白的高效回收。然而，由于金属离子暴露在层析树脂表面，任何能与其产生螯合作用的蛋白质（如富含组氨酸、半胱氨酸的蛋白质）均可吸附到树脂上，这些非特异性结合会导致重组蛋白质纯度大幅降低。为了解决上述问题，研究人员开发了一系列具有高度选择性的新型亲和材料。其中，磁性纳米颗粒因其易操作性和可重复使用性而受到广泛关注，Fe3O4/PMG/IDA-Ni2+[11]、GNTA-SPION[12]、TiO2NTs@Fe3O4NPs[13]、Fe3O4@Au/NTA-Ni2+[14]等一系列具有更高选择性的纳米材料被开发出来。此外，固定了 Ni2+、Zn2+等金属的 EDTA-壳聚糖也可以对 His 标记蛋白进行纯化[15]。值得注意的是，表位印迹增强 IMAC（EI-IMAC）技术[16]可以在材料表面形成以组氨酸标签为模板的分子印迹层，使得不含组氨酸标签的蛋白质无法靠近，从而提高目的蛋白纯度；而表面筛分固定化金属离子亲和层析（SIMAC）[17]则是利用表层聚合物网络的筛分作用实现对标记蛋白的高效纯化。与传统 IMAC 相比，这些新型材料不受宿主自身杂蛋白的干扰，可以快速且高选择性地纯化带组氨酸标签的蛋白，有望将重组蛋白的纯化提升到一个新的水平。

表1 几种传统和新型亲和标签的特征

FLAG 标签是由 8 个氨基酸组成的亲水性短肽，序列为 DYKDDDDK。作为一种人工设计的亲和标签，这 8 个氨基酸残基的排列顺序与 FLAG 标签的抗原性密切相关：N 端第二位的酪氨酸属于芳香族氨基酸，是抗原-抗体特异性反应的主要因素；而 N 端带负电的天冬氨酸和 C 端6 个氨基酸组成的亲水序列可对酪氨酸进行辅助，大大提高了 FLAG 标签的抗原性[2]。利用相应的抗 FLAG 单克隆抗体对融合蛋白进行结合，再使用过量的游离 FLAG 肽或低 pH 值甘氨酸缓冲液进行洗脱，便可以得到纯化后的目标蛋白。目前常用的抗 FLAG 标签抗体包括 M1、M2 和 M5，需要根据纯化条件和标签位置的不同选择使用。虽然FLAG 标签具有体积小、选择性高、可用于不同的表达体系等优点，但抗 FLAG 抗体树脂的高昂成本限制了其在生物技术领域中的广泛应用。近年来，Gómez-Arribas 等[18-19]设计了一种以四肽 DYKD 为模板的分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs），成功纯化出带有 FLAG 或 DYKD 标记的蛋白，又在此基础上开发了以五肽 DYKDC 为模板的 MIPs，进一步提高了结合的特异性。这种标签印迹系统在纯度、回收率和成本效益方面都优于抗体亲和柱纯化系统，为高效且廉价地纯化 FLAG 标记蛋白提供了一种新的候选方法。

1.1.2 新型短肽标签 肝素结合肽（heparin-binding peptide，HBP）由 32 个氨基酸组成，分子量为 3.6 kD，已被证明可以用于蛋白纯化[3]。根据带负电荷的肝素可以与带正电的蛋白质发生静电相互作用[20]，肝素亲和层析法常被用来纯化抗凝血酶 III、人白介素等蛋白。通过进一步结构分析，发现这些与肝素具有高亲和性蛋白的肝素结合结构域分布着特定带正电的氨基酸残基，即肝素结合序列[21]。以此序列为基础，研究人员设计了一种带正电的 HBP 亲和标签，将其融合到非肝素亲和性靶蛋白上可以促进靶蛋白与肝素产生强相互作用[22]。在天然纯化条件下，裂解液中存在的所有蛋白质几乎都可以通过肝素-琼脂糖凝胶柱被回收，而在加入尿素等变性剂时，也有 90% 以上的蛋白被成功回收。此外，可能是由于 HBP 标签上的高含量正电荷残基阻止了目标蛋白的聚集，重组蛋白可以较好地以可溶形式表达。综上所述，HBP 标签的出现为非肝素亲和性重组蛋白的纯化提供了一种简单高效的新途径。

ALFA 标签是由 13 个氨基酸组成的一种新型表位标签，在生理 pH 值条件下亲水且不带电，形成一个小而稳定的 α-螺旋[23]，与纳米抗体 NbALFA 结合时具有d=26 pmol/L 的超高亲和力[24]，可以用于重组蛋白的快速亲和纯化。ALFA 标记的目标蛋白可以结合到固定了 NbALFA 的琼脂糖树脂上，再加入 ALFA 肽进行竞争性洗脱，可以实现目标蛋白的高效回收[25]。ALFA 系统的优势在于 ALFA 标签与 NbALFA 的相互作用独立于其在蛋白中的定位，即将标签放置在目标蛋白的任何位置都能被有效识别；此外，ALFA 标签与 NbALFA 之间的强相互作用已被证明可以用于从稀释裂解液中纯化极低丰度的蛋白质[4]。然而，ALFA 系统需要在室温的条件下进行洗脱，在纯化对温度敏感的目标蛋白时洗脱效率会受损。为了进一步增强 ALFA 系统的通用性，Kilisch等[26]在 NbALFAPE的基础上开发出一种可以在 4 ℃下高效洗脱的 NbALFACE树脂，是低温纯化敏感蛋白或温度不稳定酶的理想工具。

Car9 标签是近年来新出现的一种蛋白纯化标签，由12 个氨基酸（DSARGFKKPGKR）组成，可以融合到目标蛋白的 N 端或 C 端，通过成本低廉的硅胶亲和层析达到纯化蛋白的目的[27-28]。为了扩展 Car9 的应用，Soto-Rodríguez 等[5]开发了一种小型纯化试剂盒，通过在裂解缓冲液中添加 0.3% Tween 20 以及降低洗脱时赖氨酸的浓度对纯化过程进行了优化，不仅提高了产品的纯度，还为需要快速获取毫克级蛋白质的实验室规模应用提供了参考方案。此外，Xu 等[29]借助二氧化硅自旋柱和 96 孔硼硅酸盐板建立了一个高通量的 Car9 标记蛋白回收平台，显著降低了纯化所需时间，为大规模纯化蛋白提供了可能性。总的来说，减少的纯化时间以及显著降低的纯化成本是 Car9 标记系统的主要特点，这种低成本、大规模纯化技术的可用性将有助于开创蛋白纯化的新时代。

1.2 蛋白标签

1.2.1 传统蛋白标签 谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione s-transferase，GST）是基于其对固定化谷胱甘肽的强亲和力而建立的一种标签蛋白，相对分子质量较大，约为 26 kD，可以插入目的蛋白的 C 端或 N 端，用于重组蛋白的纯化[6]。与此同时，GST 还可以作为增溶剂促进大肠杆菌表达系统中重组蛋白的折叠，防止蛋白在高效表达过程中因产生速度过快形成无活性的不溶性聚集物。除了提高重组蛋白的可溶性[30]，GST 标签还可以增加蛋白的表达量[31-33]，这两个显著的优点使其成为异源蛋白表达最常使用的亲和标签之一。然而，GST 也存在着蛋白标签固有的缺陷，即较大的分子量可能会影响目的蛋白的功能，因此常常需要利用位点特异性蛋白酶进行切除。最近，Sakhel等[33]还开发出一种 60 ℃热处理法，为热稳定性重组蛋白的 GST 标签去除提供了更加快速经济的替代方案。此外，Zou 等[34]制备出一种具有高特异性及良好重复使用性能的SnO2/SiO2-GSH NSs 纳米材料，可以用于 GST 标签蛋白的快速分离纯化，为今后相关蛋白纯化提供了一个很好的范例。

麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）是一种由 396 个氨基酸组成的蛋白标签，分子量约为42.5 kD。该标签具有伴侣蛋白活性[35]，可以作为一种非特异性分子伴侣促进靶蛋白的正确折叠，被认为是比 GST 更有效的增溶剂[36-37]，在重组蛋白表达纯化的过程中发挥着重要作用。直链淀粉树脂层析法是纯化 MBP 标记蛋白最常用的方法，在单次捕获后即可产生纯度为 70% ～ 90% 的标记蛋白[7, 36]。然而，该纯化技术存在一个不可忽视的缺点，即目前市面上售卖的直链淀粉基质对 MBP 的亲和性太弱，经常导致纯化出的蛋白产量过低。为了消除这一弊端，Nemergut 等[38]开发出一种基于蛋白-蛋白相互作用的新型亲和基质，即锚蛋白重复蛋白 off7（DARPin off7），该基质是对 MBP 表现出高度特异性的纳摩尔亲和力黏结剂，在一定程度上提高了目标蛋白的产量。此外，相对于短肽标签，较大分子量的 MBP 标签融合表达时会对宿主细胞造成很大的代谢负担，对目标蛋白的结构和功能也有一定的影响，这是目前使用 MBP 标签不可避免的问题。

1.2.2 新型蛋白标签 HaloTag 是一种 34 kD 的修饰脱卤酶，可以融合在目标蛋白末端，以共价结合的方式吸附到 HaloLink 树脂上[39]。HaloTag 技术与传统蛋白纯化方法最大的不同点在于，其与树脂的结合是不可逆的共价结合，这种牢固的结合方式克服了以往亲和标签的固有限制，能够有效捕获低表达水平的蛋白质，且允许高强度洗涤去除杂蛋白，显著提高了目标蛋白的回收率和纯度。需要注意的是，目标蛋白不能用常规方式进行洗脱，需要通过 TEV 蛋白酶在特定位点的裂解从 HaloLink 树脂中释放出来[8, 40]。此外，Locatelli-Hoops 等[41]在使用该标签纯化人源大麻素受体 CB2 时，发现这种蛋白质的功能依赖于 HaloTag 的位置，即将标签从 C 端转移到 N 端时会导致蛋白质失活。这提示我们，在添加 HaloTag 导致非活性蛋白质时，可以考虑将标签连接到蛋白的另一端来恢复其功能。近年来，研究人员对 Halo 标签进行了大量优化，新开发出 HaloTag7[42]、HaloTag8[43]等版本，大大增加了融合蛋白的表达量。

MhPA14 标签由 214 个氨基酸组成，大小约 22.5 kD，是基于除烃海杆菌 PA14 结构域的糖结合性质设计的一种新型蛋白标签，对葡聚糖树脂具有较高的亲和力，可以用于重组蛋白的一步纯化过程[44]。研究表明，GFP-MhPA14 融合蛋白与 Superdex 树脂结合后，再引入葡萄糖或 EDTA 进行洗脱，可以获得比使用 IMAC 系统更好的纯化效果[9]。鉴于葡聚糖树脂在生物化学实验室中的现成可用性，相信 MhPA14 作为一种经济高效的亲和标签在未来会得到更加广泛的使用。

2 亲和标签对重组蛋白的影响

在重组蛋白表达与纯化的过程中，亲和标签除了可以起到辅助纯化的作用，还可能对目标蛋白的理化性质造成影响。

2.1 有利影响

目前，大肠杆菌是大量表达外源蛋白的首选宿主，因为它能够快速、经济、高效地生产蛋白质。但是，大肠杆菌系统中重组蛋白的产生通常伴随着过表达蛋白的积累，其形式为不溶性和无生物活性的包涵体，增加了后续分离纯化的难度[45]。为了打破这一瓶颈，最常用的策略是借助具有促溶作用的蛋白标签（如GST、MBP、SUMO[46]、NusA[47]等）将目的蛋白表达为融合蛋白，从而促进重组蛋白的正确折叠，增加蛋白可溶性，提高目标蛋白的产量[48-49]。然而，到目前为止，这些标签增加重组蛋白可溶性的具体机制仍然知之甚少，还需要进一步的研究。

2.2 不利影响

除了上述有利影响之外，亲和标签也会对目标蛋白造成一些不利影响，包括改变蛋白构象，影响蛋白活性等。如前所述，大分子量的蛋白标签会对目标蛋白造成干扰，通常需要进行切除。一般来说，小分子量的短肽标签基本不会影响到目标蛋白，但 Singh 等[50]的研究表明，组氨酸标签的存在会改变 SP0845 蛋白的二级结构。与此同时，短肽标签有时也会对目标蛋白的生物活性造成一定的影响，例如 N 端 His 标签的存在会降低 CLIC 家族蛋白的氧化还原酶活性[51]，FLAG 标签则会导致端粒酶的加工活性下降[52]。因此，设计合适的融合标签使重组蛋白得到高效且有活性的表达，仍然是一个不小的挑战。

3 亲和标签的去除策略

由于亲和标签的存在可能会对目标蛋白的结构和功能造成一定的影响，因此常常需要在纯化过程中去除这些标签蛋白。下面介绍几种常用的标签去除策略。

3.1 内切蛋白酶法

肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶，常见切割位点为 DDDDK↓，在赖氨酸残基的 C 端处水解肽键[53]。然而，肠激酶对该典型识别序列的特异性不是很高，有时需要加入尿素提高其水解特异性[54]。值得注意的是，FLAG 标签的 C 端含有肠激酶裂解位点，酶切后可以达到无氨基酸残留。

凝血酶最常用的识别位点是 LVPR↓GS[55]，具有切割专一性强、水解效率高的优点，常常用于重组蛋白的特异性切割。但是，凝血酶的活性对温度要求较高，一般只能采用室温或 37 ℃水浴酶切。

Xa 因子由两条二硫键相连的多肽链构成，常见切割位点位于 IE/DGR↓ 序列中的精氨酸残基之后[56]，但也可能于其他碱性氨基酸残基处发生切割，特异性不高。

烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus，TEV）蛋白酶能特异性地识别七肽序列 ENLYFQ↓G/S[57]，是从重组蛋白中去除融合标签的一种有用工具。除了高度的序列特异性，TEV蛋白酶还能在低温下保持显著活性，并且不受螯合剂的影响，这些优势使其成为应用最广泛的蛋白酶之一。但是，野生型 TEV 蛋白酶常常会自我裂解生成活性大大降低的截短酶。为了解决这一问题，研究人员引入了抵抗自身失活的 S219V 突变体[58]。最近，Sanchez 和 Ting[59]还设计出另外一种 TEV-S153N 突变体，通过定向进化进一步提高了蛋白酶的催化速率。

HRV 3C 蛋白酶是一种专门设计的半胱氨酸蛋白酶，识别位点为 LEVLFQ↓GP[60]，具有高度的酶切特异性。除了酶切后会在重组蛋白的 N 端留下一个 Gly-Pro 二肽的固有缺点之外，3C蛋白酶具有的高度特异性和低温下的高活性使其成为去除重组蛋白亲和标签的常用工具。

3.2 外切蛋白酶法

外切蛋白酶主要包括羧肽酶和氨肽酶，分别可以用来切除位于目标蛋白 C 端和 N 端的融合标签。常见的羧肽酶分为 A、B 两种类型，其中羧肽酶 A 可以切割 C 端除 Lys、Arg、Pro 之外的氨基酸，而羧肽酶 B 主要用于切割C 端的 Lys 或 Arg[55]。DAPase 是最具代表性的氨肽酶，能够从融合蛋白 N 端依次切除二肽，直到出现 Lys、Arg、Gln 残基才会终止[61]。虽然外切蛋白酶不像内切蛋白酶那样常用，但是当需要去除融合蛋白的 C 端标签时，由于任何一种内切酶都会留下大量氨基酸残基，此时选择外切酶特别是羧肽酶，其实是一种更好的办法。

4 总结与展望

亲和标签介导的蛋白纯化是利用标签与配体之间的亲和作用将目标蛋白从细胞其他成分中分离出来的过程，这是外源表达重组蛋白开发利用中至关重要的环节。如前所述，目前常用的标签蛋白各有其特定的优缺点，需要根据目标蛋白的特点设计恰当的纯化策略，从而实现高产量、高纯度及高活性目标蛋白的回收。为了进一步提高纯化效率，研究人员对传统纯化系统进行了一系列优化，包括开发新基质、设计新标签去除方案等；与此同时，还开发了多种新型标签，为目标蛋白的纯化提供了更多选择。在后续利用亲和标签纯化重组蛋白的研究过程中，还须借助生物信息学、结构化学及材料科学等领域的前沿成果，设计满足短时间、低成本、高产量、多功能、绿色环保等要求的亲和标签系统，为蛋白质的大规模可持续供应提供保障。

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国家自然科学基金（82003809）；北京医院“科技新星”（BJ-2020-087）

张超，Email：zc_mdy@163.com；张传宝，Email：cbzhang@ nccl.org.cn

2023-03-13