石庆会,陈华莲,郑雅婷,叶艺榕,孙 刚

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室,福建 三明 365004;2.三明学院 资源与化工学院,福建 三明 365004)

昆虫种类繁多、形态各异,占生物圈内动物总数的一半以上,具有极强的迁徙、繁殖以及环境适应能力,几乎遍布自然界的每一个角落,对人类的农业生产和身体健康影响深远[1-2]。肠道是昆虫与外界环境连接的纽带,且栖息着大量的微生物,影响宿主昆虫的生长发育[3]。在长期的协同进化过程中,肠道微生物与宿主昆虫形成密切的共生关系,相互依赖、相互影响[4]。一方面,肠道微生物在宿主昆虫的生命活动中发挥至关重要的作用[4-5],如参与宿主的营养代谢[6]、帮助宿主的解毒调理[7]、影响宿主的生长发育与繁殖[8]、调控宿主对不良环境的适应性[9]等;另一方面,肠道微生物的群落结构、代谢活动又受到宿主昆虫肠道微环境的影响,并通过一系列策略与之适应[10]。昆虫肠道微生物包括原生动物、真菌、古生菌和细菌等,其中细菌是大多数昆虫肠道微生物的主要组成[11]。

目前,关于昆虫肠道细菌的研究主要集中在细菌的多样性及其功能方面,涉及的宿主昆虫主要包括等翅目(Lsoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、半翅目(Hemiptera)、双翅目(Diptera)和鞘翅目(Coleoptera)等,覆盖众多农业经济害虫以及与人类健康密切相关的卫生害虫[5,12-13 ]。其中,鳞翅目是昆虫纲中仅次于鞘翅目的第二大目,包括蛾、蝶两类昆虫,其数量约占昆虫总数的16%,主要作为植食者、传粉者在生态系统中发挥关键作用,具有重要的研究价值[14-15]。

散纹盛蛱蝶(Symbrenthialilaea)隶属于鳞翅目,蛱蝶科(Nymphalidae)、蛱蝶亚科(Nymphalinae),在国内主要分布于江西、福建、广西、云南和台湾等地,国外主要分布于印度北部、越南和菲律宾等地。幼虫以荨麻科的青苎麻、木苎麻、水麻等植物叶片为食,成虫喜吸食花蜜。散纹盛蛱蝶幼虫对荨麻科植物和观赏性植物有着巨大的危害,严重时仅留叶脉而使寄主植物干枯,容易造成荨麻科植物的产量降低造成经济损失。鉴于肠道微生物与宿主昆虫之间形成的稳定共生关系,有必要对散纹盛蛱蝶肠道微生物开展研究。然而目前关于这一方面的研究尚未见报道。本文利用PacBio三代高通量测序平台,测定了自然种群散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌16S rRNA基因全序列,初步分析其肠道细菌的组成与多样性特征,以期为深入研究肠道细菌的潜在功能、探讨肠道细菌与宿主的互作机制奠定基础,也为寻求新的生物防治途径提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

供试散纹盛蛱蝶成虫(以下简称SW)均采自于自然环境,样本带回实验室参考《中国蝴蝶志》[16]进行鉴定后,用75%的酒精进行体表消毒并置于-80 ℃保存备用。随机选取3个样本(SW-1、SW-2、SW-3)作为实验材料,其中SW-1采自于福建省三明市梅列区瑞云山(2021年9月),SW-2、SW-3采自于福建省三明市三元区三明学院(2021年10月)。

1.2 肠道细菌基因组DNA提取

使用E.Z.N.A.©Soil DNA Kit 提取试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S)提取散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌基因组DNA,具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。完成基因组DNA抽提后,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

1.3 肠道细菌16S rRNA基因全序列扩增与测序

将提取的DNA作为模板,对16S rRNA进行PCR扩增。利用引物27F(5’-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-RGYTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增散纹盛蛱蝶成虫肠道的16S rRNA基因全序列。PCR反应体系(20 μL)为0.4 μL的FastPfu Polymerase,4 μL的5 × FastPfu Buffer,2 μL的2.5 mM dNTPs,上下游引物(5 μM)各0.8 μL,10 ng DNA模板,ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共27个循环;72 ℃总延伸5 min。PCR仪:ABI GeneAmp©9700型。全部样本按照正式实验条件进行,每个样本3个重复。

将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物,具体方法参照试剂盒说明书执行。回收产物经Tris_HCl洗脱后,进行2%琼脂糖电泳检测。根据电泳初步定量结果,将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量,之后按每个样本的测序量要求,进行相应比例混合。混合后的DNA产物利用PacBio三代测序平台进行建库和测序,由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.4 测序数据处理

使用仪器自带的SMRTLINK(v9)处理PacBio原始序列数据,设置参数:最小通过数为3,最小精确度为0.99进行一致性CCS(circular consensus sequencing,CCS)序列的获得。再利用SMRT Portal进行序列的长度(800-2500 bp)和质量筛选。通过去除barcode、引物序列、chirmas以及含有10个连续相同碱基的序列,进一步对序列进行筛选。

1.5 肠道细菌群落组成及多样性分析

利用USEARCH(v10)软件,按照98.65%相似度对非重复序列(不含单序列)进行操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)聚类,在聚类过程中去除嵌合体,得到OTU的代表序列。将所有优化序列map至OTU代表序列,选出与OTU代表序列相似性在98.65%以上的序列,从而生成样本的OTUs结果。为了得到每个OTU对应的物种分类信息,采用uclust algorithm(v1.2.22.q)方法与Silva数据库(http://www.arb-silva.de)进行物种注释分析(设定置信阈值为0.8),并分别在各个分类水平:门(Phylum),纲(Class),目(Order),科(Family),属(Genus),种(Species)统计各样本的群落组成。利用MOTHUR(v.1.35.1)软件进行Alpha多样性指数分析和绘制Shannon-Wiener曲线,利用QIIME(v1.9.0)绘制Rank-Abundance曲线。

2 结果与分析

2.1 散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌16S rRNA基因全序列测序结果

基于PacBio三代测序平台,完成了散纹盛蛱蝶成虫3个样本肠道细菌的16S rRNA全序列高通量测序,共获得48 458条CCS序列,总长度为69 573 368 bp。经过优化后共获得35 586条reads,在98.65%的相似度下被聚类为2 547个OTUs(表1)。

表1 散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌测序的基本信息

2.2 散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌组成及其丰度

基于OTUs的分类结果,3个样本共注释到9个门,15个纲,25个目,48个科,71个属,217个种(表1)。

在门分类阶元水平,散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌共注释到了放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)等9个门,其中变形菌门为优势菌门,平均相对丰度为55.89%,拟杆菌门为次优势菌门,占比27.66%(图1A)。

注:基于OTUs的分类结果,将平均相对丰度低于0.01%的部分合并为“Others”在图中显示。

在纲分类阶元水平,散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌平均相对丰度前10位的依次是α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)、噬几丁质菌纲(Chitinophagia)、γ-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)、柔膜菌纲(Mollicutes)、β-变形杆菌纲(Betaproteobacteria)、放线菌纲(Actinomycetia)、异常球菌纲(Deinococci)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia),其中α-变形杆菌纲为优势菌纲,占比40.23%,噬几丁质菌纲为次优势菌纲,占比25.61%(图1B)。

在目分类阶元水平,散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌平均相对丰度前10位的依次为生丝微菌目(Hyphomicrobiales)、噬几丁质目(Chitinophagales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、虫原体目(Entomoplasmatales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、棒状菌目(Corynebacteriales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、立克次式体目(Rickettsiales)、肠杆菌目(Enterobacterales)、栖热菌目(Thermales),其中生丝微菌目和噬几丁质目分别为优势菌目和次优势菌目,占比分别为27.88%和27.61%(图1C)。

在科分类阶元水平,散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌平均相对丰度前10位的依次为噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、红细菌科(Rhodanobacteraceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、螺原体科(Spiroplasmataceae)、拜叶林克式菌科(Beijerinckiaceae)、叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、无形体科(Anaplasmataceae)、栖热菌科(Thermaceae),其中噬几丁质菌科为优势菌科,占比27.61%(图1D)。

在属分类阶元水平,散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌平均相对丰度前10位的依次为沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、罗河杆菌属(Rhodanobacter)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、螺原体属(Spiroplasma)、Methylovirgula、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia),其中沉积物杆状菌属为优势菌属,占比21.24%(图1E)。

在种分类阶元水平,平均相对丰度前10位的依次为木兰景天杆菌(Sediminibacteriummagnilacihabitans)、柑橘僵化病螺原体(Spiroplasmacitri)、Methylovirgulaligni、Bradyrhizobiumsp011516665、亚西亚羊蹄甲菌(Asaiabogorensis)、Chitinophagavietnamensis、副伯克霍尔德菌(Paraburkholderiafungorum)、Asaialannensis、Mesorhizobiumterrae、Bradyrhizobiumottawaense_A,其中木兰景天杆菌为优势菌种,占比20.78%(图1F)。

2.3 散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌Alpha多样性

Alpha多样性是指对单个样品物种多样性分析,是菌群结构的重要特征。本文分析了Chao指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数等Alpha多样性指数,其中Chao指数、Ace指数反映样品中群落的丰富度(species richness)即指群落中物种的数量,而不考虑群落中每个物种的丰度情况,而Shannon指数反映群落多样性,Simpson指数反映群落中优势种的集中程度。Chao指数、Ace指数和Shannon指数越大,Simpson指数越小,说明样品中群落多样性越高、物种越丰富。从Alpha多样性统计结果(表2)可以看出,3个样本的Chao指数在1 737.141 0～2 095.629 2,Ace指数在1 943.055 1～2 321.301 3,Shannon指数在6.778 2～7.592 1,Simpson指数在0.02 46～0.054 0,表明散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌群落有较高的丰富度和多样性。

表2 散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌的Alpha多样性指数

Shannon-Wiener曲线是利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建的,以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时,说明测序数据量足够大,可以反映样本中绝大多数的微生物信息。从本研究构建的曲线(图2)可以看出,3个样本均趋向平坦,说明测序数据已经足够大,更多的测序量不会引起物种多样性的显著增长,可以反映样本中绝大多数的微生物信息,基于现有数据量的分析结果较为精确可靠。

图2 散纹盛蛱蝶3个样本肠道细菌的Shannon-Wiener曲线图

Rank-abundance曲线是一种分析多样性的方式。可用来说明多样性的两个方面,即物种丰度和物种均匀度。曲线横轴反映的是样本物种丰富程度,曲线越宽,样本中物种组成越丰富;曲线纵轴反映的是物种的均匀度,曲线越平滑,样本中的物种分布越均匀。从分析结果(图3)可以看出,3个样本曲线与横轴的交点距离都较远,同时三条曲线的整体走向较为平滑,表明散纹盛蛱蝶成虫肠道中的细菌具有较高的物种丰度和物种均匀度。

图3 散纹盛蛱蝶3个样本肠道细菌的Rank-abundance曲线图

3 讨论

基于16S rRNA基因全序列和PacBio三代测序平台,本研究首次完成了散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌群落结构与多样性分析,共注释到9个门,15个纲,25个目,48个科,71个属,217个种。

相关研究表明,尽管不同种类的昆虫肠道菌群优势菌门有所差别,但均以变形菌门为最主要的肠道菌群之一[17]。本研究结果显示,散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌的优势菌门也是变形菌门,且在肠道细菌中平均相对丰度最高(55.89%)。此外,拟杆菌门也是散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌的次优势菌门,其平均相对丰度为27.66%,此结果与半翅目的褐飞虱(Nilaparvatalugens)[18]、大青叶蝉(Cicadellaviridis)[19],鞘翅目的光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)[20]、栖北散白蚁(Reticulitermessperatus)[21]肠道优势菌门类似。有些昆虫肠道中的优势菌门则相对简单,仅为变形菌门,如鳞翅目的茶尺蠖(Ectropisobliqua)[22]和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)[23],双翅目的柑橘大实蝇(Bactroceraminax)[24]、长须白蛉(Lutzomyialongipalpis)[25]、泽兰实蝇(Procecidocharesutilis)[26],鞘翅目的椴六点楔天牛(Saperdavestita)[20],半翅目的小贯小绿叶蝉(Empoascaonukii)[27]以及脉翅目的中华通草蛉(Chrysoperlasinica)[28]等。值得一提的是,即便是同一个目分类阶元的昆虫肠道的优势菌门也会有所不同,如鞘翅目天牛科的光肩星天牛和天牛,天牛肠道的优势菌门仅有变形菌门,而光肩星天牛肠道优势菌门则有变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门[20];半翅目叶蝉科的大青叶蝉和小贯小绿叶蝉,大青叶蝉的优势菌门除了变形菌门外还包括拟杆菌门[19],而小贯小绿叶蝉的优势菌门仅为变形菌门[27]。因此,昆虫肠道细菌的组成与结构受多种因素的影响,尤其是昆虫种类、食性以及环境条件等。

在属分类阶元水平,散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌共注释到71个属,其中沉积物杆状菌属为优势菌属,占21.24%。该结果与已报道的其他昆虫肠道中的优势菌属有所差异,如泽兰实蝇以沃尔巴克氏体属为优势菌属[26];以木材为食的白蚁(Nasutitermesarborum)肠道内则以能降解木质纤维素的密螺旋体属(Treponema)为优势菌属[29];不同食性的美国白蛾肠道菌群优势菌属也不相同,以人工饲料喂养的美国白蛾优势菌属为希瓦氏菌属(Shewanella),以桑树饲养的美国白蛾优势菌属是能产蛋白酶且有助于昆虫对蛋白消化吸收的葡萄球菌属(Staphylococcus),以柳树为食料的美国白蛾优势菌属是能产酶、纤维素、蛋白酶和脂肪酶且对昆虫的消化吸收起了重要作用的芽孢杆菌属(Bacillus)[30]。沉积物杆状菌属是革兰氏阴性菌,目前已从富营养化水库的沉积物[31]、人参田的土壤[32]、淡水水库[33]、鱼缸的沉积物[34]等分离出8种该属细菌。最新研究表明从南加州地区淡水流蓝藻中发现一种新的沉积物杆状菌属物种,它与相关蓝藻宿主存在一定的共生关系,可通过产生细菌素和毒黄菌素抵御致病菌在宿主体内定殖,宿主则为其提供营养和稳定的微生境[35]。因此,沉积物杆状菌属在散纹盛蛱蝶肠道中的功能以及与宿主之间的互作机制都有待于进一步研究。

沃尔巴克氏体属是一类在节肢动物体内广泛分布的共生细菌,能够通过诱导细胞质不亲和、诱导孤雌生殖、雌性化和杀雄作用等多种方式调控寄主生殖行为,此外还能增强宿主的抗逆性[23]。本研究结果显示,在散纹盛蛱蝶成虫肠道中同样注释到了沃尔巴克氏体属,但其平均相对丰度较低(2.5%)。除沃尔巴克氏体属外,螺原体属也在散纹盛蛱蝶成虫肠道中得到注释,而且其平均相对丰度较高(10.55%)。螺原体属是一类革兰氏阳性菌,除了在植物上有发现外,还分布于鞘翅目的蜜蜂、鳞翅目的蝴蝶和蛾、半翅目的叶蝉、木虱等昆虫体内[36]。相关研究发现,螺原体属影响宿主的机制与沃尔巴克氏体属相似,除了能够经卵传播杀死受感染的雌果蝇和雌性金斑蝶(Danauschrysippus)的雄性后代以及缩短宿主豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)的寿命并抑制其繁殖外,还能为宿主带来更好的适合度[37-38]。植食性昆虫仅通过取食植物汁液难以满足其自身生长发育的需求,但其体内细菌的存在能弥补这种饮食不平衡,有研究表明蚜虫体内的螺原体属为其提供了汁液中没有的多种必需氨基酸[37]。其次,还能增强宿主的抗逆性。如玉米矮缩螺原体(Spiroplasmakunkelii)能增强感染叶蝉在没有植物宿主的寒冷冬季的生存能力[36];一些螺原体属能增强受感染的果蝇和蚜虫宿主抵御寄生线虫、寄生蜂和真菌病原体的能力[39-40]。大多数昆虫体内的螺原体属不致病,但也有例外,如蜜蜂螺原体(Spiroplasmamelliferum)和蜜蜂五月病螺原体(Spiroplasmaapis)可在蜜蜂的血淋巴中大量繁殖而致其死亡[36-40]。散纹盛蛱蝶成虫喜食花蜜和植物汁液,其肠道内螺原体属的存在,是否有益于散纹盛蛱蝶的营养代谢,增强其抗逆性,或是引起雌雄比例不协调,有待后续实验进一步验证。

4 结论

本研究基于16S rRNA全序列的高通量测序技术,首次分析了采自于自然环境下的散纹盛蛱蝶成虫样本的肠道细菌群落结构及多样性,丰富了散纹盛蛱蝶成虫肠道细菌的相关信息,有利于今后进一步研究和利用肠道微生物的功能。昆虫肠道细菌的多样性不仅受到昆虫种类的影响,同时也与昆虫的食性以及栖息环境相关。因此,下一步将重点研究不同发育阶段和不同地理条件的散纹盛蛱蝶肠道细菌群落结构及其多样性,采用宏基因组技术更全面地获取散纹盛蛱蝶肠道细菌多样性特征以及相关功能,为阐明肠道微生物与宿主昆虫之间的互作机制提供更有力依据。