张杭颖,洪玉莹,杨 琳,黄勃诚,陈 月,张君诚

(1.三明学院 资源化工学院,福建 三明 365004;2.三明学院 海峡理工学院,福建 三明 365004;3.药用植物开发利用福建省高校工程研究中心,福建 三明 365004)

免洗洗手液兼具抑菌和护肤的功能,与传统清洁产品相比,具有避免交叉感染和实用性较强的优点[1-2]。免洗洗手液主要成分为乙醇和丙三醇,它是通过提高乙醇含量或添加邻苯基苯酚(OPP)、三氯羟基二苯醚(DP300)等化学杀菌剂达到抑菌功能[3-4],但长期使用高浓度酒精及OPP、DP300等添加剂会造成手部皮肤干燥、粗糙等现象[5]。因此,利用天然产物作为免洗洗手液的抑菌添加剂备受关注。

五指毛桃,桑科榕属(MoraceaeFicus),源植物为粗叶榕(FicushirtaVahl),主要分布于福建、广东、广西等地,以根入药,具有天然的椰子香味[6-7],主要活性成分包括补骨脂素、多糖、黄酮等[8-10]。有研究表明,其提取液具有抗炎、抗氧化、体外抑菌作用,是理想的洗手液天然添加剂[11-14]。

因此,本实验选择采用80%的乙醇-超声波法提取五指毛桃根部的活性成分,通过非靶向测序和高效液相色谱法,检测提取物的种类和活性成分含量,并研发制备五指毛桃免洗洗手液,以期为五指毛桃免洗洗手液的生产提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 醇提液制备

五指毛桃,种植于福建省三明市三元区莘口镇高山村(东经117°14′54″,北纬26°10′36″),其高约90 cm,全缘叶与缺刻叶共存,果实为青灰色,小且圆,根浅黄色,皮柔韧,有香气。经三明学院张君诚教授鉴定为粗叶榕。实验中选取五指毛桃的根作为实验材料。

将五指毛桃的根洗净,烘干至恒重,将其碾磨成粉,过60目筛备用。参考超声辅助乙醇提取法[15],取上述五指毛桃粉末5 g,溶于100 ml 80%乙醇,在37 ℃下,超声提取60 min,放进冷冻高速离心机中4 ℃,8 000 r/min离心15 min,弃沉淀,获得五指毛桃醇提液。

1.2 醇提液非靶向检测

使用旋转蒸发仪(N-1000D-W垂直型,日本EYELY)干燥五指毛桃醇提液,获得五指毛桃醇提液干粉,称取适量五指毛桃干粉。加入含2-氯-L-苯丙氨酸(4 mg/L)的甲醇600 μL,涡旋振荡30 s,室温超声15 min后离心10 min。取上清液滤膜过滤后放入检测瓶中,参照李娇珍等色谱和质谱条件,用于LC-MS检测[16]。

1.3 醇提液活性成分检测

采用高效液相色谱法测定五指毛桃醇提液补骨脂素含量[17]。高效液相色谱条件:Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相-乙腈-水(35∶65),流速1.0 mL/min,柱温35 ℃;进样量20 μL,检测波长245 nm。经精密度、稳定性和加样回收试验检测均符合要求后,以补骨脂素为标准品,用水和乙醇分别配制成0.54 mg/mL的补骨脂素标准溶液。吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mL补骨脂素标准溶液,加水或50%乙醇溶液补至10 mL。再使用0.45 μm针孔滤膜过滤,上样测定,并通过线性回归分析进行标准曲线的制作。

分别以芦丁、没食子酸、葡萄糖为标准品,采用硝酸铝法[18]、Folin-ciocalteu法[19]和硫酸-苯酚法[20]制备标准曲线,测定总黄酮、多酚和多糖含量,并计算五指毛桃醇提液中各种活性成分含量。计算公式为

(1)

式(1)中,A为活性成分含量(%),c为测得吸光值或峰面积对应的活性成分浓度(mg/mL),V为溶液体积(mL),n为稀释倍数,m为称取的五指毛桃质量(mg)。

1.4 免洗洗手液制备

选择配方为五指毛桃醇提液与丙三醇的比值为3∶1(乙醇含量60%),5∶1(乙醇含量66%)和7∶1(乙醇含量70%)制备免洗洗手液,与乙醇含量70%的酒精洗手液对比(市场中免洗洗手液的乙醇含量浓度均高于70%,故本实验直接选取70%浓度的酒精作为对照组),观察并分析其pH变化、分层情况、气味、使用感等指标参数,综合评价五指毛桃免洗洗手液(表1)。

表1 免洗洗手液成分四种组合 单位:mL

1.5 抑菌作用检测

将直径为6 mm的无菌小圆滤纸片,分别浸泡于最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同浓度的酒精洗手液、五指毛桃提取液及甘油中。挑取大肠杆菌单克隆,在LB液体培养基培养40 min后,涂布于固体培养基平板上。再将固体培养基平板划分4块区域,将浸泡4种免洗洗手液的小圆滤纸片依次贴在平板的4个区域,37 ℃培养8 h后观察并测量每一个平板上小圆片的抑菌圈大小。

在LB培养基中分别添加15%的五指毛桃免洗洗手液(五指毛桃醇提液与甘油的比例为3∶1)、酒精免洗洗手液(酒精与甘油的比例为3∶1)、五指毛桃醇取液和甘油,以LB培养基为空白对照,测定在接种大肠杆菌0、100、140、160、180、200、220 min条件下OD 600值的变化。

在LB培养基中分别添加2.5%的五指毛桃免洗洗手液(五指毛桃醇提液与甘油的比例为3∶1)、酒精免洗洗手液(酒精与甘油的比例为3∶1)、五指毛桃醇取液和甘油,以LB培养基为空白对照,测定在接种大肠杆菌0、60、100、120、140、150、160 min时OD 600的变化值。

2 结果与分析

2.1 五指毛桃醇提液成分检测

五指毛桃醇提液中共检测到864种物质,主要含有黄酮类化合物(38种)、酚类化合物(35种)、糖类化合物 (76种)、香豆素类 (12种)、脂肪酰 (109种)、类固醇和类固醇衍生物 (51种)、苯和苯的衍生物 (138种)和羧酸及其衍生物 (123种)等成分,其比例分别为4.40%、4.05%、8.80%、1.39%、12.62%、15.97%和14.24% (图1)。其中,黄酮类化合物中,检测到表儿茶素 (EC)、木犀草素、黄芩苷等30种黄酮类组分和金雀异黄酮、2′,5,7-三羟(基)-4′-甲氧异黄酮等8种异黄酮组分。香豆素类化合物中包含五指毛桃质量评价指标补骨脂素。

图1 五指毛桃醇提液中检出的物质种类

2.2 五指毛桃醇提液活性成分含量

以补骨脂素为标准品(纯度≥98%,上海阿拉丁生化科技有限公司),测得在6～7 min之间,回归曲线方程为Y=78.571x-35.289 (R2=0.996 0)。五指毛桃醇提液在6～7 min也出现峰值,确定该峰物质为补骨脂素(图1)。通过峰面积计算五指毛桃醇提液补骨脂素含量为0.046% (图2)。

图2 补骨脂素标准品和五指毛桃样品的色谱图

以芦丁为标准品,制备标准曲线回归方程分别为Y=11.995x-0.012 (R2=0.999 5),计算五指毛桃醇提液总黄酮含量为0.690%。以没食酸为标准品,制备标准曲线回归方程为Y=10.951x+0.032,总酚含量为1.120%。葡萄糖标准曲线分别为Y=49.138x+0.074 (R2=0.996 0),测得多糖含量为16.968%(图3)。

2.3 不同配方免洗洗手液的理化性质及感官评价

2.3.1 不同配方免洗洗手液pH变化

测定四种配方免洗洗手液在0、1、3、6、12、24、48、96、144 h时pH值的变化,发现含五指毛桃醇提液的免洗洗手液均呈酸性,而酒精和甘油配比的免洗洗手液呈碱性(图3)。4种配方洗手液pH均呈下降趋势,144 h后4种免洗洗手液的pH均呈酸性。其中酒精免洗洗手液pH下降最多,达13.85%,五指毛桃醇提液与甘油比例为3∶1,5∶1和7∶1的免洗洗手液分别下降了12.44 %,9.98%和8.60%(图3)。由此可知,含五指毛桃醇提液的免洗洗手液比酒精免洗洗手液pH稳定,且五指毛桃醇提液含量越高,pH越稳定。

2.3.2 不同配方免洗洗手液外观评价

观察4种免洗洗手液144 h后外观变化,其中酒精免洗洗手液澄清透亮、不分成,且无沉淀物。4种免洗洗手液在144 h后均不分层。但随五指毛桃醇提液的升高,呈现浑浊,且有沉淀物或油脂(表2)。

2.3.3 不同配方免洗洗手液感官评价

在免洗洗手液感官评价中,4种不同配方免洗洗手液的细腻度和延展度均较好。其中含五指毛桃醇提液的免洗洗手液伴有植物香气且保湿度好。五指毛桃醇提液与甘油比为3∶1的免洗洗手液清爽且黏稠度低,其他免洗洗手液表现为油腻且黏稠。综合各感官指标可知,五指毛桃醇提液与甘油比为3∶1的免洗洗手液的感官评价优于其他配方的免洗洗手液(表3)。

表3 4种配方免洗洗手液感官评价表

综上,五指毛桃醇提液与甘油比例为3∶1配比的免洗洗手液其呈酸性,较稳定,且长时间放置澄清透亮、不分层,且无沉淀。感官评价中清爽度、黏度、细腻度、延展度和保湿度都表现良好,且带有植物香气,是五指毛桃免洗洗手液的最佳配方。

2.4 五指毛桃免洗洗手液抑菌作用评价

2.4.1 抑菌圈检测结果

放置浸泡最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同浓度的酒精免洗洗手液、五指毛桃提取液和甘油的小圆纸片于大肠杆菌培养基中,测量并统计平板上的抑菌圈的大小。结果显示,浸泡五指毛桃醇提液和五指毛桃免洗洗手液的圆滤纸片抑菌圈大小分别为2.13、2.33 mm,抑菌效果较好(表4)。浸泡相同浓度的乙醇免洗洗手液抑菌圈大小为1.20 mm,低于五指毛桃免洗洗手液和五指毛桃醇提液,且差异显著(P<0.01)。浸泡甘油的圆滤纸片未出现抑菌圈,表明甘油无抑菌作用(表4)。

表4 4种配方免洗洗手液抑菌特征

2.4.2 细菌生长曲线测定结果

测得添加15%最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同浓度的酒精免洗洗手液、五指毛桃提取液和甘油的LB培养基中大肠杆菌0、100、140、160、180、200、220 min的OD600值结果显示,空白对照组(仅LB培养基)大肠杆菌生长经历迟缓期和对数增长期,稳定生长,符合细菌生长特点。添加甘油的培养基中,大肠杆菌迟缓期时间增长,且相同时间内大肠杆菌增值数量较空白对照组减少(图4)。添加最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同浓度的酒精免洗洗手液和五指毛桃提取液的培养基,大肠杆菌培养液OD600值在220 min内几乎无变化。

图4 添加物浓度为15%时5种培养基中大肠杆菌的OD600值变化

为进一步分析相同酒精浓度下五指毛桃免洗洗手液中醇提液的抑菌效果,降低添加物浓度至2.5%,检测0、60、100、120、140、150、160 min的大肠杆菌OD 600值,图5显示:最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同浓度酒精免洗洗手液和五指毛桃醇提液的培养基均能有效延长迟缓期,其中添加五指毛桃免洗洗手液和五指毛桃醇提液的培养基的抑菌效果高于添加酒精免洗洗手液的培养基。由此可知,五指毛桃醇提液比相同浓度的酒精具有更强的抑菌作用。

图5 添加物为2.5% 时三种培养基中大肠杆菌的OD600值变化

3 分析与讨论

五指毛桃醇提液中共检测到864种物质,主要含有38种黄酮类化合物、35种酚类化合物、76种糖类化合物、12种香豆素类、109种脂肪酰、138种苯和苯的衍生物和123种羧酸及其衍生物等成分。醇提液中总黄酮、多酚、多糖和补骨脂素的含量分别为0.690%、1.120%、16.968%和0.046%。五指毛桃醇提液中的补骨脂素、黄酮、多酚等物质均具有明显的抑菌及抗氧化作用[6,13],是免洗洗手液优良的添加剂。

五指毛桃醇提液制备的免洗洗手液呈酸性,而酒精洗手液则呈碱性。有研究表明,黄酮、非挥发性有机酸、高级脂肪酸、生物碱等成分含量越高的提取物,pH越小[21]。成年人与少年人手部皮肤的pH都小于5,这是皮肤抵御微生物侵入的重要方式[22]。免洗洗手液呈碱性或中性时,会破坏皮肤的酸性环境,使肌肤感觉紧绷、干燥;皮肤表面pH值若长期处于中性或者碱性,将直接或间接影响角质形成细胞的代谢,引发角质细胞增生、分化的异常,导致皮肤屏障功能改变,角质层致密性降低等病症[2]。因此,含五指毛桃提取液的免洗洗手液可将表皮皮肤pH值维持在弱酸性,达到护肤的功效。

五指毛桃醇提液制备的免洗洗手液的抑菌效果优于乙醇免洗洗手液(表4、图5～6)。研究表明,五指毛桃提取液可通过干扰细胞壁合成,损伤胞浆膜,影响细胞蛋白合成,影响核酸合成,干扰遗传密码复制,对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌均具有抑制作用[13,23]。同时,感官评价也证实五指毛桃醇提液制备的免洗洗手液优于乙醇免洗洗手液,为研发天然提取物添加型免洗洗手液提供新的思路及方向。