张兆博,侯黎明,李平华,杜陶然,王中宇,吴承武,黄瑞华*

(1.南京农业大学养猪研究所,南京 210095;2.南京农业大学淮安研究院,淮安 223001)

我国猪肉消费需求已从“量稳”进入“质升”阶段,如何改善猪肉品质已成为畜牧业生产的新目标。以往有较多研究发现日粮纤维可以影响猪肉品质,但因日粮纤维代谢过程复杂,对机体的调控形式也可能存在直接或间接的作用途径,导致其作用机理研究一直不清。日粮纤维是指饲料中不能被动物分泌的消化酶直接消化的细胞壁成分,主要包括纤维素、半纤维素、果胶和木质素等。本课题组前期研究发现:与同生理阶段和同体重的大白猪育肥阉公猪相比,二花脸猪可以耐受更高的纤维日粮,且7%的麸皮替代基础日粮可以显著提高二花脸猪背最长肌红度值(a值),初步分析发现,7%的麸皮替代基础日粮改变了二花脸猪肌纤维类型,肌纤维类型标记基因MyHCI的mRNA表达水平升高,而MyHC IIb和MyHC IIx的mRNA和蛋白表达水平显著降低[1],提示适量的日粮纤维添加可通过改变肌纤维类型改善二花脸猪的肉色,提高猪肉品质。

日粮纤维在猪体内主要由后肠定植的微生物发酵生成短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)、CO2、H2等物质[2],同时日粮纤维可能通过影响肠道微生物的平衡和代谢,诱导微生物产生氨基酸、小肽等小分子代谢物[3-6],调控动物整体代谢和健康。近年来,随着DNA高通量测序、基因组学等技术和学科的快速发展,特别是代谢组学技术的日益成熟,为研究日粮纤维的分子营养调控机制提供了新的方法与思路。代谢组学是研究生物体受到干预前后代谢产物图谱及其动态变化的一种技术,具有技术通用性强、数据库简易等特点[7],且代谢处于生命调控过程的末端,相较于其他组学而言,代谢组学提供的是生物学的终端信息,更接近于生物体表型[8]。作为“后基因组学时代”的一项新兴技术,代谢组学平台在动物营养调控的研究中已经得到了广泛的应用[9],但基于代谢组学技术解析日粮纤维调控猪肉品质机理的研究还鲜见报道。因此,本研究选择可代表和体现生物体整体生理系统代谢变化特征的二花脸猪血浆样品[10],采用GC-MS非靶标代谢组学技术对其代谢物进行全面分析、鉴定和比较,并在体外细胞水平开展代谢物的功能验证试验,探究日粮纤维对猪血浆代谢物的影响,筛选日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物,为揭示日粮纤维的营养功能并对其进行合理的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以二花脸猪基础日粮组(EHL_0%)和7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%)的血浆样品为试验材料[1]。试验用到的细胞分离自1日龄二花脸公猪的背最长肌(购自常熟市畜禽良种有限公司)。Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶和L多聚赖氨酸购自Sigma公司;DMEM/F12培养基、丙氨酰谷氨酰胺(Glutamax)、非必需氨基酸(NEAA)和丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自DCELL Biologics公司;细胞生长因子(bFGF)购自PeproTech公司;血清替代物(Ultroser G)购自美国PALL公司;双抗(青霉素、链霉素)购自Hyclone公司。

1.2 试验设计

本研究中血浆代谢组学所用到的样品材料与前期本课题组已发表的文章[1]相同。选择二花猪基础日粮组(EHL_0%,5.13% ADF,12.84% NDF)和7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%,5.7% ADF,14.43% NDF)正试期第28天的血浆样品进行非靶向代谢组学检测,鉴定两个组别差异代谢物,并与前期基础日粮组和7%麸皮替代基础日粮组二花脸猪背最长肌的肉质表型结果(肉色、pH和滴水损失)进行相关性分析,鉴别日粮纤维影响二花脸猪肉质性状的候选代谢物,探究肉质性状与代谢物之间的相互关系;然后在体外分离培养二花脸猪的肌卫星细胞并诱导分化获得肌管细胞,评价遴选的候选代谢产物对二花脸猪肌管细胞肌纤维类型转变的影响,探究日粮纤维影响二花脸猪肉品质的潜在调控机理。

1.3 猪血浆收集与样品处理

正试期第28天,所有试验猪通过前腔静脉采集全血于肝素抗凝管中,上下轻轻颠倒混匀后,室温静置30 min,3 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液,制作血浆样本,随后将血浆转移至1.5 mL离心管中,液氮速冻后,于-80 ℃冰箱保存。在开展GC-MS代谢组检测时,从-80 ℃冰箱取出样品,4 ℃缓慢融解后分别取各组样品200 μL,加入300 μL提取液(v(甲醇):v(乙腈)=2∶1(含5%的内标L-2-氯-苯丙氨酸));涡旋30 s混匀后,冰水浴超声萃取30 min;将样品于-20 ℃静置30 min,然后高速离心15 min(4 ℃,13 000 r·min-1);取上清,装入玻璃衍生小瓶中,氮气吹干;于玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液(15 mg·mL-1),涡旋2 min后于37 ℃震荡培养箱中进行90 min肟化反应;再加入80 μL的BSTFA(含1%TMCS)衍生试剂,涡旋2 min后于70 ℃反应60 min;取出样本后,在室温放置30 min,进行GC-MS代谢组学检测。

1.4 色谱-质谱(GC-MS)分析

本试验所用分析仪器为Agilent公司的8890B-5977B气相色谱质谱联用仪(Agilent, USA)。衍生化后样本用分流模式注入GC-MS系统进行分析,进样量1 μL,分流比10∶1。样品经DB-5MS毛细管柱(40 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent122-5532G)分离后进入质谱检测。进样口温度 260 ℃,载气为高纯氦气,载气流速1 mL·min-1,隔垫吹扫流速3 mL·min-1,溶剂延迟5.5 min。升温程序为初始温度60 ℃,平衡0.5 min,然后以8 ℃·min-1的速度升至310 ℃,并维持6 min。质谱条件为电子轰击离子源(EI),传输线温度为310 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN),质量扫描范围:50～500 m·z-1,扫描频率为3.2 scan·s-1。

1.5 数据处理与分析

GC-MS的原始文件经MassHunter workstation Quantitative Analysis(v10.0.707.0)软件进行搜库鉴定及数据预处理,将质谱信息与代谢数据库进行匹配,根据质谱匹配度鉴定代谢物。主要数据库为Fiehn database等商业数据库,导出CSV格式的三维数据矩阵,该矩阵信息包括样品名称、代谢物名称和峰面积等。将数据矩阵导入SIMCA-P 14.1软件,分别进行峰面积归一化、主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)。以变量权重值(variable important in projection, VIP)>1.0,且t检验(P<0.05)为标准筛选差异代谢物,使用AMDIS软件进行差异代谢物定性鉴别、匹配分析。将匹配到的差异代谢物导入 MetaboAnalyst 5.0数据库进行代谢通路分析,同时借助KEGG数据库构建相关的代谢网络。再者,将课题组前期得到的肉质表型数据[1]与血浆中筛选出显著性差异代谢物进行相关性分析,以皮尔森相关系数为原理进行分析,计算肉质性状与差异代谢物的相关系数值,其数值的绝对值越大,说明两者关系越密切,P<0.05表示显著相关,P<0.01表示极显著相关,以Heatmap图展示两者之间的相关性。

1.6 二花脸猪肌卫星细胞分离与鉴定

选取1日龄健康纯种的二花脸仔猪,颈动脉放血处死后,用75%消毒酒精擦拭全身,进行消毒处理。在超净工作台内快速切取仔猪背最长肌样品,用含双抗的PBS冲洗肌肉2次后转移到无菌培养皿,用眼科镊、眼科剪尽可能地去除筋膜、神经、血管和脂肪组织,除去杂质的肌肉转入新的无菌培养皿,充分剪碎肌肉组织,约1 mm3大小。转移肌肉组织样品至细胞培养瓶,室温静置5～10 min,待肌肉样品沉淀后,用巴氏吸管吸弃上清。按照 2∶1 体积比向肌肉组织样品中加入0.28%的 I 型胶原酶(即2.8 mg·mL-1),37 ℃水浴摇床震荡充分消化2 h,至组织样呈黄色黏稠状液体,充分消化后,加含胎牛血清的培养基终止消化,收集消化的细胞悬液和未消化完全的组织块经100目、200目细胞筛过滤。收集滤液,1 000 r·min-1离心5 min,弃除上清液,在沉淀中加入适量的完全生长培养基重悬(完全培养基配方为:F12/DMEM,20% FBS,1% Glutamax,1% NEAA,1% Sodium Pyruvate,2 ng·mL-1bFGF,1%双抗),经细胞计数后接种于培养瓶中,置于37 ℃、50 mL·L-1CO2的培养箱中静置培养2 h后,吸出上清于另一新培养瓶即为肌卫星细胞。纯化后的细胞接种培养瓶中培养,隔天进行换液,运用免疫荧光技术检测Pax7蛋白的表达情况,Pax7染色阳性细胞比例较高表明肌肉卫星细胞分离成功。

1.7 免疫荧光染色

将制备的猪肌卫星细胞接种至预放有细胞爬片的24孔板中,接种孔周围用无菌PBS填充,待细胞在爬片上生长融合至60%～80%时,用PBS漂洗3次,加4%的多聚甲醛室温固定15 min,用0.2%TritonX-100透化10 min,PBS洗3次,每次5 min;使用免疫荧光封闭液室温封闭30 min,加入Pax7抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank, 1∶50)4 ℃孵育过夜;PBS漂洗后用二抗Cy3山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(碧云天,A0521,1∶1 000)避光室温孵育1 h;用DAPI(碧云天,C1002,1∶5 000)染核5 min;PBS漂洗后用抗荧光淬灭封片剂封片,通过荧光显微镜捕获图像。

1.8 代谢物十七烷酸处理二花脸猪肌管细胞

将原代二花脸猪肌卫星细胞接种在6孔板上(设计5个组,每组2个重复,共10个孔),每个孔中的细胞数相等(约为5×105个);加入完全培养基培养细胞,待细胞生长至亚融合状态时,改用分化培养基(含0.4%血清替代物的DMEM/F12培养基)进行诱导分化培养,分化至第4天时可观察到明显的多核肌管。根据十七烷酸的溶解度信息,首先用去离子水(ddH2O)作为溶剂配制成母液,然后用分化培养基稀释到所需的工作液浓度(0、0.2、2、20、200 μmol·L-1),处理分化第4天的肌管细胞48 h,然后用浓度为0.012 5%的胰蛋白酶300 μL消化上述肌管3 min,收集肌管细胞的RNA样品,然后通过实时荧光定量PCR检测不同肌纤维类型的标志基因MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb和MyHCIIxmRNA的表达水平。

1.9 实时荧光定量PCR

采用TRIzol法提取细胞总RNA,通过试剂盒(EVOM-MLVRT Kit with gDNA Clean for qPCR,艾科瑞)反转录合成cDNA后,参照ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)说明书在QuantStudio5实时荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR所用引物由北京擎科生物公司设计并合成,引物序列见表1。每个样本设3个重复,以GAPDH作为内参基因通过2-△△Ct法换算目的基因相对表达量。将试验结果数据表示为“平均值±标准差”,并采用SPSS 20.0软件对各组数据进行方差检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

表1 定量PCR引物信息Table 1 Primers information for qPCR

2 结 果

2.1 血浆差异代谢物的筛选及鉴定

首先采用无监督的主成分分析(PCA)对二花脸猪基础日粮组(EHL_0%)和7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%)血浆的GC-MS数据从整体上进行评价,结果显示样本基本处于95%置信区间内(图1)。为进一步明确两组间的差异性,采用有监督的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)追踪这些差异代谢物在基础日粮组和7%麸皮替代基础日粮组间的变化趋势,结果如图2所示,两组区分较明显,表明不同日粮纤维水平导致血浆形成特异性的代谢组。利用t检验的P值和差异倍数(Fold change, FC)绘制火山图对血浆差异代谢物进行可视化,如图3所示,共发现5个代谢物上调,4个代谢物下调。选择OPLS-DA模型得到的VIP>1,同时P<0.05的化合物作为显著差异代谢物,最终筛选出9个显著差异富集的代谢物(表2)。

图中每个点代表了1个样品。横坐标为第1主成分,纵坐标为第2主成分,2点之间在横、纵坐标上的距离代表了样品受第1主成分或第2主成分影响下的相似性距离。椭圆区域表示本组样本在95%的置信度下分布在此区域内;超过此区域表示样本可能异常 Each point in the figure represents a sample. The x-axis represents the first principal component (PC1), the y-axis represents the second principal component (PC2), and the distance between two points on the x-axis and y-axis represents the similarity distance of the sample under the influence of the PC1 or PC2. The ellipse region indicates that the samples of this group were distributed in this region with 95% confidence. Exceeding the ellipse region indicates that the sample may be abnormal图1 EHL_0%组和EHL_7%组血浆代谢组样品PCA得分图Fig.1 PCA scores of plasma metabolome samples in EHL_0% and EHL_7% groups

横坐标为第一预测主成分解释度,主要反映组间差异;纵坐标为第一正交成分解释度,主要反映组内差异。椭圆区域表示本组样本在95% 的置信度下分布在此区域内;超过此区域表示样本可能异常The x-axis represents the interpretation degree of the first predicted principal component, which mainly reflects the differences between groups. The y-axis represents the degree of interpretation of the first orthogonal component, which mainly reflects the intra-group differences. The ellipse region indicates that the samples of this group were distributed in this region with 95% confidence. Exceeding this region indicates that the sample may be abnormal图2 EHL_0%组和EHL_7%组血浆代谢组样品OPLS-DA得分图Fig.2 OPLS-DA scores of plasma metabolome samples in EHL_0% and EHL_7% groups

横坐标为代谢物在两组间差异富集水平的倍数值,即log2FC,纵坐标为代谢物差异富集水平的统计学检验值,即-lg (P value)值,值越高表示差异越显著,横纵坐标的均为对数化数值。图中每个点代表一个特定的代谢物,点的大小表示VIP值。灰色点(nosig)代表没有差异的代谢物,蓝色点(down)代表差异下调的代谢物,红色点(up)代表差异上调的代谢物The x-axis represents the fold change of the differential enriched metabolites between two groups, namely log2FC; The y-axis represents the statistical value of the differential enriched metabolites, namely-lg (P value) value. The higher the value, the more significant difference it is. Each dot in the figure represents a specific metabolite, and the size of the dot indicates the VIP value. The gray dots (nosig) represent metabolites with no difference, the blue dots (down) represent the down-regulated metabolites, and the red dots (up) represent up-regulated metabolites图3 EHL_0%组和EHL_7%组血浆代谢组火山图Fig.3 Volcanic map of plasma metabolome in EHL_0% and EHL_7% groups

表2 血浆差异代谢物表Table 2 Table of differential metabolites in plasma

为了更直观地展示差异血浆代谢物在不同样本之间富集水平的差异,对血浆样本中所有显著差异代谢物进行层次聚类(图4)。结果显示,二花脸猪血浆差异代谢物明显分为两大类,其中D-threitol、1, 4-dideoxy-1, 4-imino-D-arabinitol、tyrosine和urea 4种代谢物在基础日粮组(EHL_0%)丰度较高,heptadecanoic acid、p-toluenesulfonic acid、D-allose、pipecolic acid和 beta-myrcene 5种化合物在7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%)中丰度较高。

从蓝到红颜色深度表示代谢物富集丰度从低到高。A37～A43为基础日粮组样品,B38～B51为7%麸皮替代基础日粮组样品Colors from blue to red indicate the enrichment level of metabolites from low to high. A37-A43 were the basal diet group samples, and B38-B51 were the 7% bran replacement basal diet group samples图4 血浆差异代谢物聚类分析图Fig.4 Cluster analysis diagram of differential metabolites in plasma

2.2 血浆差异代谢物的代谢通路分析

为探究饲喂7%日粮纤维对二花脸猪代谢通路的影响,利用KEGG数据库对二花脸猪基础日粮组(EHL_0%)和7%麸皮替代基础日粮组(EHL_7%)血浆样品鉴定到的9个差异代谢物进行代谢通路富集分析,结果表明(图5),二花脸猪的血浆差异代谢产物主要富集的代谢途径包括:黑色素生成途径、ABC转运体途径、酪氨酸和色氨酸生物合成途径等。

横坐标为富集率,纵坐标为KEGG通路。图中气泡的大小代表该通路中富集的差异代谢集的数量,气泡的颜色表示显著性富集P值的大小The x-axis represents the enrichment rate, and the y-axis represents KEGG pathway. In the figure, the size of the bubble represents the amount of metabolites enriched into the metabolic set for specific pathway, and the color of the bubble represents the magnitude of the significance enrichment P value图5 血浆差异代谢物的代谢通路分析图Fig.5 Pathway analysis diagram of plasma differential metabolites

2.3 血浆差异代谢物与肉质表型的相关性分析

将课题组前期测定的二花脸猪肉质表型数据与血浆差异代谢物丰度值进行Pearson相关性分析,结果发现仅有十七烷酸与二花脸猪背最长肌24 h的红度值(a24 h)呈显著的正相关(图6)。推测7%麸皮替代基础日粮组提高了代谢物十七烷酸的水平,进而提高了背最长肌24 h的红度值(a24 h)。

图中的右侧为代谢物名称,底部为不同的肉质表型,图中每个格子表示两个属性(代谢物与肉质表型)之间的相关性,不同颜色代表属性间相关系数的大小。L表示亮度,a表示红度,b表示黄度,DL表示滴水损失,pH表示背最长肌的酸度。*. P<0.05The right side of the figure is the name of metabolite, and the bottom is the meat quality phenotypes. In the figure, each grid represents the correlation between two features (metabolite and meat quality phenotypes), and different colors represent the magnitude of correlation coefficient between features. L is brightness, a is redness, b is yellow, DL is drip loss, pH is the acidity of longissimus dorsi muscle. *. P<0.05图6 血浆差异代谢物与肉质表型的关联分析Fig.6 Correlation analysis of plasma differential metabolites and meat quality traits

2.4 十七烷酸处理对二花脸猪肌管细胞MyHC I表达的影响

选用差速贴壁法分离二花脸猪骨骼肌肌卫星细胞(图7)。刚分离出的原代骨骼肌卫星细胞比较小,呈球形,折光性强;培养48 h后,细胞贴壁,呈梭形或纺形;72 h后贴壁完全,细胞逐渐延展成梭形。利用免疫荧光检测肌卫星细胞标记蛋白Pax7的阳性率,发现刚分离的二花脸猪肌卫星细胞的纯度约为50%(图8),可用于后续代谢物的功能研究。

A. 刚分离的猪肌卫星细胞;B. 分离培养48 h的肌卫星细胞;C. 分离培养72 h的肌卫星细胞A. Newly isolated muscle satellite cells; B. Satellite cells cultured for 48 h; C. Satellite cells cultured for 72 h图7 二花脸猪肌卫星细胞的形态(40×)Fig.7 The morphology of Erhualian pig muscle satellite cells(40×)

A. 肌卫星细胞核DAPI染色结果;B. 肌卫星细胞Pax7蛋白免疫荧光结果;C. 叠加图像A. DAPI nucleus staining of muscle satellite cells; B. Immunofluorescence of Pax7 protein in muscle satellite cells; C. Merged image图8 二花脸猪肌卫星细胞Pax7的免疫荧光检测图(100×)Fig.8 Immunofluorescence of Pax7 in muscle satellite cells of Erhualian pig(100×)

为研讨十七烷酸对二花脸猪肌管细胞肌纤维类型组成的影响,利用不同浓度(0、0.2、2、20和200 μmol·L-1)的十七烷酸处理分化第4天的肌管细胞48 h,然后利用实时荧光定量 PCR检测十七烷酸对4种肌管肌纤维类型标记基因表达水平的影响,发现MyHCI基因mRNA表达水平随着代谢物处理浓度的升高而显著提高,其它基因mRNA的表达量没有发生显著变化(图9)。推测,十七烷酸可能通过改变MyHCI的表达提高了其背最长肌的红度值。

**. P<0.01图9 十七烷酸对二花脸猪肌纤维类型标记基因相对mRNA表达水平的影响Fig.9 Effect of heptadecanoic acid on relative mRNA expression of muscle fiber type marker genes in Erhualian pig

3 讨 论

日粮纤维在过去一直被认为是一种抗营养因子,随着研究的深入,越来越多的学者认识到日粮纤维作为猪日粮的营养成分对其生命活动的重要作用[11-12]。适量日粮纤维有利于维持猪正常肠道生理和机体代谢平衡[13-15]。本课题组前期研究发现,适量日粮纤维的添加可通过改变肌纤维类型改善二花脸猪的肉色,提高猪肉品质,但其机理不清。基于对日粮纤维发酵和代谢过程的分析,推测肠道微生物发酵纤维后不仅可以产生SCFAs,也会诱导肠道微生物合成其他代谢产物[16]。而前期的试验结果表明,日粮纤维的添加并未改变肠道短链脂肪酸含量,但影响了二花脸猪肠道微生物的丰度以及结肠内容物和肝的代谢产物(结果尚未发表),因此推测,日粮纤维可能通过影响二花脸猪代谢产物来调控肌纤维类型的转变。基于该假设,本试验通过GC-MS非靶向代谢组学,检测了添加不同水平日粮纤维后二花脸猪血浆的代谢产物。结果显示,7%麸皮替代基础日粮提高了二花脸猪血浆代谢物十七烷酸、哌啶酸、对甲基苯磺酸、D-阿洛糖和月桂烯的水平。相关性分析表明仅有十七烷酸与二花脸猪背最长肌24 h红度值(a24 h)呈显著正相关。

十七烷酸是公认的乳脂摄入生物标志物[17],除了来源于反刍动物脂肪外,它们也可以内源合成,例如,有研究报道十七烷酸可从肠道衍生的丙酸或其他短于十五碳的奇数链饱和脂肪酸合成[18]。Weitkunat等[19]研究发现,饲喂膳食纤维可以显著增加小鼠体内丙酸的含量,同时也会增加血浆磷脂中十五烷酸和十七烷酸的含量。李碧侠等[20]研究发现,饲粮中添加苜蓿草粉可加快苏山猪背最长肌中葵酸、棕榈酸和十七烷酸等饱和脂肪酸富集,减少亚油酸碳二烧酸、二十碳三烯酸等多不饱和脂肪酸富集,从而改变苏山猪肌肉中脂肪酸的含量,改善肌肉嫩度和风味品质。十七烷酸是一种奇数链饱和脂肪酸,可以通过脂肪酸合成酶介导,以丙酸和戊酸为前体重复缩合而成[21]。另有研究报道,十七烷酸可以通过转化为丙酰辅酶A,并进一步转化为琥珀酰辅酶A,为三羧酸循环提供无杂合中间体,调节线粒体代谢,从而有利于改善骨骼肌信号转导和维持葡萄糖稳态[18]。

研究表明,猪骨骼肌肌纤维包括4种不同的肌纤维类型,即慢速氧化型肌纤维(Ⅰ型)、快速氧化型肌纤维(Ⅱa型)、快速酵解型肌纤维(Ⅱb型)和中间型肌纤维(Ⅱx型),分别表达MyHC-I/slow(Myh7)、MyHC-IIa(Myh2)、MyHC-IIb(Myh4)和MyHC-IIx(Myh1)基因[22-24]。猪肉色性状与肌纤维类型组成相关,慢速氧化型纤维(Ⅰ型)直径小,具有更小的滴水损失,肌红蛋白含量高,颜色更鲜红;相反的,快速酵解型纤维(Ⅱb型)直径大,具有更大的滴水损失,屠宰后pH下降快,蛋白质降解程度增加,容易产生颜色苍白、质地松软和表面渗水(pale soft exudative, PSE)的肉[25-28]。相关研究发现,Ⅰ型肌纤维的含量越高,宰后pH的下降速率和幅度越低,肌肉的感官品质越好[29-30]。Ryu和Kim[31]研究也证实I型纤维与红度值呈正相关(r=0.22;P<0.001),而IIb型纤维与红度值呈负相关(r=0.33;P<0.001),增加氧化型肌纤维含量有利于改善猪肉色泽,提升猪肉品质。本研究表明,十七烷酸处理可以提高二花脸猪肌管细胞MyHCI基因的表达。因此推测,日粮纤维的添加可能通过影响肠道微生物的平衡和代谢,通过诱导肠道微生物产生十七烷酸,经血液直接或经肝组织间接作用于肌肉组织,进而影响猪肉色性状。

4 结 论

添加日粮纤维可以引起二花脸猪血浆代谢组发生显著的变化,在基础日粮组和7%麸皮替代基础日粮组二花脸猪血浆中共鉴定出9个差异代谢物,其中4个差异代谢产物在基础日粮组含量较高,5个差异代谢产物在7%麸皮替代基础日粮组含量较高。通过将差异代谢物与肉质表型进行相关性分析,发现血浆差异代谢物中仅有十七烷酸与二花脸猪背最长肌24 h红度值(a24 h)呈显著正相关。体外肌管细胞试验进一步表明,十七烷酸处理可能通过提高二花脸猪肌管细胞MyHCI基因的表达,改善其肉色性状。本研究初步阐明了适量日粮纤维添加改善猪肉色性状的分子机理,为非常规日粮的合理利用提供了理论依据。