刘嘉伟, 王明玖*, 曹克璠, 何丽君, 郝新艳, 张慧敏, 郝 璐

(1.内蒙古农业大学草地资源教育部重点实验室/草原与资源环境学院, 内蒙古 呼和浩特 010011;2.内蒙古农业大学农学院, 内蒙古 呼和浩特 010019)

代谢组学是研究生物体内源性代谢物质的种类、数量及其在内外因素作用下变化规律的学科,是生物体在内外因素共同作用下的最终结果。我们可通过代谢物的含量或浓度变化研究植物的生理状态特征,从而对植物特定生化过程有更深层次的理解[1]。随着时代的快速进步,代谢组学技术多用于探究植物应对不同环境胁迫的代谢物变化[2],对于分析豆科植物与根瘤菌共生固氮过程中代谢产物的变化也同样发挥重要的作用。共生固氮是豆科植物和相应根瘤菌之间发生的一系列复杂的化学和物理反应,包括引起双方信号传递过程、寄主选择和抑制植物防御系统的基因表达的变化。豆科植物—根瘤菌的相互作用通常始于氮贫瘠的土壤中,豆科植物分泌出类黄酮的代谢物[3-4],根瘤菌把类黄酮作为识别信号,通过Nod基因进行合成和释放[5]。豆科植物根系分泌物中的黄酮类化合物在低氮条件下对根瘤菌有趋化信号作用[6],与异黄酮化合物一样,黄酮类化合物同样具有寄主特异性,有研究表明寄主特异性类黄酮与根瘤菌NodD蛋白相互作用,转录因子诱导Nod基因的表达,导致Nod因子的产生[7-8],由寄主特异性Nod基因编码产生的酶,会影响根瘤原基对寄主的选择[9]。

高加索三叶草(Trifoliumambiguum)是一种多年生根蘖型豆科牧草,原产于东欧和高加索地区,具有适应性强、耐寒性突出的特点[10],在原产地其能与根瘤菌结合进行结瘤固氮作用[11-12],固氮效率与白三叶相似[13-14]。但是由于高加索三叶草对根瘤菌具有特异选择性[15],当引种至其他地区栽培时,不能与根瘤菌发生互作关系,大多会失去结瘤和固氮能力,导致高加索三叶草前期建植能力弱,影响推广种植。

由内蒙古农业大学培育出的‘蒙农三叶草1号’(TrifoliumambiguumBieb. ‘Mengnong No.1’)是中国第一个高加索三叶草品种,其适应性强、生态位广,在适应性、耐牧性、生物产量方面优于白三叶(T.repens)和红三叶(T.pratence),更适合在北方寒冷地区生长和种植[16-17]。经过多年研究发现‘蒙农三叶草1号’可以与本土根瘤菌结合,进行结瘤固氮作用,突破了高加索三叶草不能与当地根瘤菌结合这一瓶颈。因此,本研究以‘蒙农三叶草1号’为研究对象,探究与根瘤菌相互作用的机理,研究根瘤菌对根系代谢物的影响,对解释高加索三叶草结瘤固氮机理,为增强高加索三叶草的结瘤固氮能力提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为内蒙古农业大学选育的高加索三叶草品种‘蒙农三叶草1号’。供试菌株为‘蒙农三叶草1号’根瘤中分离得到的根瘤菌,经过16S rDNA鉴定为豌豆属根瘤菌(RhizobiumLeguminosarum)。

1.2 样品的处理及采集

幼苗培养:选取籽粒饱满的‘蒙农三叶草1号’种子200粒,用体积分数75%酒精消毒10 min,无菌水冲洗干净后,置于铺有滤纸的无菌培养皿中,26℃避光萌发4 d。将萌发后的幼苗移栽至装满无菌蛭石的10 cm×10 cm的黑色营养钵中,每钵移栽3株,施加100 mL的无菌Hoagland无氮营养液。将营养钵置于光照培养箱中(26℃;光照16 h/黑暗8 h;相对湿度50%)继续培养1 d后,进行试验。

Hoagland无氮营养液:435 mg·L-1K2SO4;136 mg·L-1KH2PO4;241 mg·L-1MgSO4;36.7 mg·L-1FeNaEDTA;0.83 mg·L-1KI;6.2 mg·L-1H3BO3;16.9 mg·L-1MnSO4·H2O;8.6 mg·L-1ZnSO4·7H2O;0.25 mg·L-1Na2MoO4·2H2O;0.025 mg·L-1CuSO4·5H2O;0.025 mg·L-1CoCl2·6H2O;444 mg·L-1CaCl2。

根瘤菌菌悬液的制备:将前期已经分离并鉴定得到的根瘤菌分别接种至YMA液体培养基中[18],于180 r·min-1、28℃振荡培养至光密度值(OD600值)>0.5时,10 000 r·min-1离心10 min,倒掉上清液用无菌水配置成OD600值为0.5的菌悬液,备用。

试验处理:试验设置接种根瘤菌和不接种根瘤菌(CK)2个处理。接种根瘤菌处理方法为:在无菌条件下,在移栽有3株幼苗的黑色营养钵中,用移液枪将1 mL根瘤菌菌悬液(OD600=0.5)滴至每株幼苗根部后,添加100 mL无氮Hoagland营养液,将其置于光照培养箱中培养。不接种根瘤菌(CK)处理方法为:在无菌条件下,在移栽有3株幼苗的黑色营养钵中,在幼苗添加100 mL无氮Hoagland营养液,将其置于光照培养箱中培养。每处理重复10钵。光照培养箱的培养条件为:温度26℃;光照16 h/黑暗8 h;相对湿度50%。将培养9 d的不同处理的‘蒙农三叶草1号’幼苗根系用液氮速冻,并于-80℃保存备用,其中接种根瘤菌的样品编号为G_9,不接种根瘤菌(CK)的样品编号为CK_G_9,每组样品设置6次重复。

1.3 根系代谢产物的LC-MS分析

将“1.2”中的样品G_9和CK_G_9送至上海美吉生物医药科技有限公司,利用非靶向代谢技术(LC-MS/MS)进行代谢产物的定性定量分析。将‘蒙农三叶草1号’根系进行前期处理,将得到的上清液进行上机分析,运用AB-SCIEX公司的超高效液相色谱串联飞行时间质谱UPLC-TropleTOF系统进行LC-MS分析。取等体积的所有样本代谢物混合制备成质控样品(Quality control,QC),在仪器分析过程中,每10个样品中插入1个QC样品,以考察整个分析过程的重复性。将得到的LC-MS原始数据运用Progenesis QI(Waters Corporation,Milford,USA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐,最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵,将MS和MSMS质谱信息与代谢公共数据库HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)数据库进行匹配,得到代谢物信息[19]。

预处理后的数据上传至美吉生物云平台上(https://cloud.majorbio.com)进行数据分析。运用R软件包ropls(Version1.6.2)进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA),对数据的可靠性进行初步判定。对得到的可靠数据进行Student’s t检验和差异倍数分析。基于PLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)和student’s t检验P值来确定差异代谢物,VIP >1、P<0.05的代谢物即为显著差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系结瘤情况

‘蒙农三叶草1号’接种根瘤菌后,根系出现了结瘤现象(图1)。根瘤数量、根瘤重量与根瘤面积在接种根瘤菌后出现了显著性的增加(P<0.05)(表1)。

表1 接种与未接种根瘤菌的‘蒙农三叶草1号’结瘤情况比较

图1 接种与未接种根瘤菌的‘蒙农三叶草1号’结瘤及生长情况对比

2.1 接种根瘤菌的‘蒙农三叶草1号’根系中代谢产物的主成分分析

对样品进行主成分分析,G_9与CK_G_9样品间相互分离,证实试验数据准确且可靠。处理间存在显著的差异,在图中距离较远,说明重复性较高。QC重叠在一起,说明检验的数据可靠性高,可以进行下一步试验(图2)。

图2 接种与未接种根瘤菌的‘蒙农三叶草1号’根系中代谢产物的主成分分析

2.2 接种根瘤菌的‘蒙农三叶草1号’根系中代谢产物的偏最小二乘判别分析

通过对不同处理下根系代谢产物进行PLS-DA分析,不同处理下的样品均分列于两侧,说明两组样品分离程度较大(图3)。通过PLS-DA置换检验(图4),并对模型进行参数计算,样品间的模型主要质量参数R2X为0.513,R2Y为0.991,Q2为0.937,说明PLS-DA模型稳定可靠性较好(表2)。

表2 PLS-DA模型参数表

图3 接种和未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中代谢产物的偏最小二乘判别分析

图4 接种和未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中代谢产物的偏最小二乘判别分析的置换检验

2.3 ‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物分析

运用单维分析(t检验)和多维分析PLS-DA相结合的方法(VIP>1,P<0.05),得到接种与未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物(Differential Metabolite,DAM),结果共筛选出249个DAMs(图5)。

图5 接种与未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物的火山图

2.4 ‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物的KEGG通路分析

对全部的DAMs进行KEGG统计分析发现,DAMs在新陈代谢过程中分别在“次生代谢产物的生物合成”“氨基酸代谢”“碳水化合物代谢”“其他氨基酸代谢”“核苷酸代谢”和“辅助因子和维生素代谢”中注释15,9,4,4,3和3个DAMs;在遗传信息处理中,DAMs在“翻译过程”中注释到2个;在环境信息处理中,DAMs在“信号转导”和“膜运输过程”中分别注释了1和3个(图6)。

图6 接种与未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物的KEGG通路分析

2.5 ‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物KEGG富集分析

对DAMs进行KEGG富集分析发现,共有75个DAMs富集在47个KEGG通路中,其中主要富集在黄酮和黄酮醇的生物合成,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,类黄酮生物合成,乙醛酸和二羧酸代谢和柠檬酸循环通路,在泛酸盐和辅酶A的生物合成、赖氨酸生物合成、组氨酸代谢、甘油磷脂代谢、赖氨酸降解、ABC转运体和苯丙烷代谢通路中也有富集(图7)。

图7 接种与未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物的KEGG富集分析

2.6 ‘蒙农三叶草1号’根系中差异代谢物种类及其数量的变化

对接种与未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中的DAMs进行KEGG化合物分类,发现22种DAMs属于不同化合物类型,其中有9种DAMs属于类黄酮类化合物,分别为黄豆黄甙、异鼠李素、黄芪甲素、山奈酚、槲皮素、杨梅素、蟛蜞菊内酯、异山奈和根皮苷,含量均表现为显著增加;有2种DAMs属于苯丙素类化合物,分别为香豆素和芥子醇,其中香豆素含量显著增加,芥子醇含量显著降低。蜜二糖是唯一的糖类化合物,含量显著增加。在其余化合物中,除柠檬酸和壬二酸外,其他均表现为含量显著增加(表3)。

表3 接种与未接种根瘤菌‘蒙农三叶草1号’根系中的主要差异代谢物

2.7 ‘蒙农三叶草1号’根系结瘤关键通路中差异代谢物的变化分析

对DAMs的KEGG通路及富集情况进行整理分析,共有16种化合物的含量在TCA循环、苯丙素生物合成和类黄酮生物合成过程中发生变化(图8)。‘蒙农三叶草1号’接种根瘤菌后,类黄酮生物合成途径中的根皮苷、山奈酚、槲皮素、杨梅素和黄豆黄甙含量显著增加。苯丙素生物合成过程中的香豆素和香草醛含量显著增加,芥子醇含量显著降低(表4)。‘蒙农三叶草1号’与根瘤菌结合后,酮戊二酸、精氨酸和天冬氨酸含量显著增加,促进了苯丙素和类黄酮生物合成过程。类黄酮化合物含量增加,促进了‘蒙农三叶草1号’与根瘤菌的相互作用。

表4 接种根瘤菌后‘蒙农三叶草1号’根系结瘤关键通路差异代谢物含量变化

图8 接种根瘤菌后‘蒙农三叶草1号’根系结瘤关键通路中差异代谢物的变化

3 讨论

‘蒙农三叶草1号’接种根瘤菌后,鉴定到的DAMs主要参与次级代谢产物的生物合成、氨基酸代谢过程、膜运输和信号转导过程。ABC-转运体可以参与植物对细菌的生物胁迫与非生物胁迫的反应,在大豆(GlycinemaxMerr.)中,ABC-转运体可以参与根系化合物的分泌,在结瘤过程中起到重要的作用[21]。本研究发现,‘蒙农三叶草1号’在结瘤过程中,DAMs在ABC-转运体通路中显著富集,说明ABC-转运体也参与了‘蒙农三叶草1号’结瘤固氮作用。

在植物体三羧酸循环中,酮戊二酸主要参与能量的代谢,是碳氮代谢过程的关键调节因子[22],它能反映植物碳氮代谢情况,也是调节信号转导蛋白和代谢相关酶的信号分子[23]。豆科植物根瘤菌将氮固定成氨的过程是通过谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶催化完成的[24],酮戊二酸可以对硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶和谷氨酰胺合成酶进行催化作用[25],从而促进氮代谢过程。‘蒙农三叶草1号’接种根瘤菌后,酮戊二酸含量显著增加,意味着根瘤菌促进了‘蒙农三叶草1号’根系酮戊二酸含量的增加,加速了谷氨酰胺合成酶催化作用,促进氮代谢过程。此外,本研究还发现,‘蒙农三叶草1号’接种根瘤菌后,根系中精氨酸含量显著增加,有可能是由于酮戊二酸促进了氨基酸含量的变化。精氨酸可以贮藏氮素营养,生成的前体物质可以参与植株的生长、抗逆性等生理生化作用,有利于促进豆科植物根瘤的生长[26]。研究发现,植物在缺氮情况下,根系天冬氨酸含量明显下降[27]。Bacanamwo等[28]认为,根瘤的固氮活性与天冬氨酸有关。本研究中,‘蒙农三叶草1号’根系天冬氨酸含量显著增加,说明其在接种根瘤菌9 d时,天冬氨酸促进了根瘤菌定殖和结瘤作用。

本研究对接种根瘤菌后的‘蒙农三叶草1号’根系代谢物进行分析,对得到的DAMs进行KEGG化合物分类,共有9种化合物属于黄酮类化合物。在豆科植物与根瘤菌共生过程中,类黄酮化合物是关键的信号分子化合物[20],可以传导豆科植物早期结瘤信号,并对结瘤基因进行诱导。因此,类黄酮化合物作为宿主特异性固氮共生体,对维持根瘤菌与植物共生至关重要。

类黄酮是植物中苯丙酸代谢和乙酸—丙二酸途径的次生代谢产物。所有的黄酮类化合物都是莽草酸途径产生的苯丙氨酸和乙酰辅酶A羧化反应产生的丙二酰辅酶A的衍生物[29]。有研究表明,在接种根瘤菌时添加黄酮诱导剂,可以增加根瘤菌在土壤中的竞争力[30-31]。黄酮类化合物山奈酚和槲皮素受黄酮-3’-羟化酶(F3’H)和黄酮-3’,5’-羟基化酶(F3’5’H)催化,可以生成杨梅素[32]。山奈酚可以作为根瘤菌的诱导剂,诱导根瘤菌定殖在豆科植物根系中[33]。本研究中,接种根瘤菌后,‘蒙农三叶草1号’根系山奈酚、槲皮素和杨梅素含量显著增加,说明类黄酮化合物山奈酚、槲皮素和杨梅素均在‘蒙农三叶草1号’早期结瘤过程起到了促进作用[34]。

香豆素化合物是植物合成的重要次级代谢物,除了在植物摄取铁的过程中起作用,还可以作为共生细菌、病原体的信号分子,具有抗菌和抗病毒的特性[35]。有益微生物可以诱导香豆素分泌到植物根际,保护植物免受致病性攻击[36]。也有研究发现,香豆素会抑制固氮细菌的生长和固氮作用[37]。本研究中,‘蒙农三叶草1号’在接种根瘤菌后,香豆素含量显著增加,说明在根瘤菌进入根系后触发了香豆素的保护机制,但后期对结瘤的影响目前还不明确,需要进一步研究。

‘蒙农三叶草1号’在接种根瘤菌后,可能导致TCA循环中酮戊二酸与柠檬酸含量的变化,从而引发部分氨基酸,如精氨酸与天冬氨酸含量的显著增加。由精氨酸合成的泛酰硫氢乙胺的含量的增加诱导类黄酮生物合成和苯丙素生物合成中的部分黄酮类化合物显著增加,释放Nod因子,从而促进根瘤菌的定殖和结瘤过程。

4 结论

本研究首次运用代谢组学测序技术,对‘蒙农三叶草1号’接种根瘤菌后的根系代谢产物进行了分析,共鉴定到249个差异代谢物。其中,精氨酸、天冬氨酸、酮戊二酸、山奈酚、槲皮苷、根皮苷、杨梅素和黄豆黄甙含量显著增加,促进了‘蒙农三叶草1号’与根瘤菌的结合,这8种代谢物是影响结瘤过程的关键代谢物。