尚子慧，刘清泉，图雅，苏芮，吴明侠（.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；.首都医科大学附属北京中医医院感染性疾病科，北京 0000；3.中国中医科学院医学实验中心，北京 00700；4.中国中医科学院中医药发展中心，北京 00700）

退热方为临床经验方，由首都医科大学附属北京中医医院刘清泉教授结合多年临床治疗经验自拟。该方由荆芥穗、栀子、牛蒡子、生麻黄、杏仁、柴胡、青蒿、玄参8 味药组成，具有解表散风、宣肺凉血的功效，临床多用于治疗流行性感冒，且疗效显著[1]。本课题组前期[2-4]采用UHPLC-Q-Orbitrap Fusion HRMS技术对退热方汤剂中所含成分进行了解析，并发现退热方中多种苷类成分均具有抗流感和抗炎作用。该方化学成分复杂，组方药材产地分布广泛，质量控制有一定难度。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法，建立退热方中6 种苷类成分同时测定的方法，并结合网络药理学方法与体外实验，挖掘6种成分抗流感、抗炎作用的信号通路，探求退热方发挥药理活性的潜在作用机制，为其质量标准研究和临床应用提供参考。

1 材料

1.1 试剂与试药退热方处方中药（荆芥穗、牛蒡子、栀子、生麻黄、苦杏仁、青蒿、玄参、柴胡）购于郑州张仲景大药房顺河路店，经河南中医药大学药学院杨晶凡副教授鉴定，荆芥穗为唇形科植物荆芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗，牛蒡子为菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果实；栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实；生麻黄为麻黄科植物草麻黄EphedrasinicaStapf 的干燥草质茎；苦杏仁为杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟种子；青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分；玄参为玄参科植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，柴胡为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根。牛蒡子苷对照品（批号：RFS-N00411812016，纯度＞98%）、哈巴俄苷对照品（批号：RFS-H02001911019，纯度＞98%）、苦杏仁苷对照品（批号：RFSK00111812016，纯度＞98%）、西红花苷Ⅰ对照品（批号：RFS-X00202010023，纯度＞98%），成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷（批号：MUST-17030405，纯度＞99.77%），成都曼思特生物科技有限公司；栀子苷对照品（批号：drk-0541-960529，纯度＞98%），成都德锐可生物科技有限公司；甲醇、甲酸均为色谱纯；试验用水为自制超纯水。

小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中国科学院上海细胞所；DMEM 培养基和胎牛血清，美国GIBCO 公司；噻唑兰（MTT，批号：917Q0511）、PBS 缓冲液、PBST 缓冲液、小鼠TNF-α ELISA 试剂盒、NO 检测试剂盒、牛血清白蛋白，北京Solarbio 科技有限公司；单组分TMB 显色液和终止液，武汉伊莱瑞特公司；二甲基亚砜（DMSO）和脂多糖（LPS），美国Sigma公司。

1.2 仪器WatersE2695 型高效液相色谱仪，美国Waters 公司；METTLER 十万分之一分析天平，梅特勒—托利多仪器有限公司；SB-1100型水浴锅，上海爱郎仪器有限公司；KQ-50B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；超纯水机，杭州泽南科技有限公司；N-1100 减压旋蒸仪，上海爱郎仪器有限公司；高效液相色谱C18柱，Agela天津博纳艾杰尔科技有限公司；CO2培养箱、酶标仪，美国Thermo 公司；IC1000 Countstar 自动细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司；ECLIPSETS100LED-FMV显微镜，日本东京尼康公司；TDZ4-WS 台式低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～10 min，95%→65%B；10～25 min，65%→50%B；25～50 min，50%→25%B；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃，流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液制备精密称取苦杏仁苷、栀子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、哈巴俄苷、西红花苷Ⅰ对照品，用甲醇定容于容量瓶中，摇匀，经稀释后，得质量浓度分别为苦杏仁苷2.02 mg·mL-1、栀子苷2.00 mg·mL-1、木犀草苷2.01 mg·mL-1、牛蒡子苷1.49 mg·mL-1、哈巴俄苷0.25 mg·mL-1、西红花苷Ⅰ0.25 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备按照处方量称取荆芥穗、牛蒡子、栀子、生麻黄、苦杏仁、青蒿、玄参及柴胡，根据本课题组前期优化的最佳水提工艺，10 倍量水浸泡30 min，武火煮开后转用文火煎煮20 min，过滤。滤渣加10 倍量水后继续煎煮过滤，合并滤液。然后精密量取25.00 mL 低温水浴蒸干，用60%甲醇定容至10 mL容量瓶中，用0.22 μm滤膜过滤即得。

2.4 方法学考察

2.4.1专属性试验 精密吸取对照品和供试品溶液各10 μL，分别按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰。结果见图1。结果显示供试品分离效果较好，且在254 nm 波长下，各对照品与供试品保留时间一致，具有较好的专属性，理论塔板数均不低于5 000。

2.4.2线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品溶液，加入甲醇制成每1 mL含有苦杏仁苷2 000 μg、栀子苷2 000 μg、木犀草苷2 000 μg、牛蒡子苷1 500 μg、西红花苷Ⅰ250 μg、哈巴俄苷250 μg 的混合对照品溶液，再逐级稀释，共制得6个浓度的混合对照品溶液。精密吸取上述各个浓度的混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以浓度（μg·mL-1）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），得到各个对照品的线性回归方程和相关系数。见表1。结果表明苦杏仁苷、栀子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、西红花苷Ⅰ和哈巴俄苷在各自浓度范围内线性关系良好。

2.4.3精密度试验 取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱峰面积。结果苦杏仁苷、栀子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、西红花苷Ⅰ和哈巴俄苷峰面积的RSD 分别为1.84%、1.42%、0.96%、1.08%、1.57%和0.76%，说明仪器精密度良好。

2.4.4稳定性试验 取同一供试品溶液，在室温条件下分别于0、2、6、10、16、24 h 各进样10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积。结果供试品溶液中苦杏仁苷、栀子苷、木犀草苷、牛蒡子苷和西红花苷Ⅰ、哈巴俄苷峰面积的RSD 分别为2.43%、1.40%、1.76%、2.51%、2.08%和2.29%，说明该供试品在室温条件下24 h 内保持稳定，可供含量测定。

2.4.5重复性试验 取同一批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积并计算各成分含量及平均值。结果苦杏仁苷、栀子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、西红花苷Ⅰ和哈巴俄苷的平均含量（n=6）分别为3.82、4.03、1.03、1.95、0.22、0.14 mg·g-1，RSD 分别为1.88%、1.91%、0.56%、0.66%、1.14%和1.20%，说明该方法具有良好的重复性。

2.4.6加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液9份，分成3组，每组3份，每份吸取10.00 mL，分别加入相当于供试品溶液中80%、100%、120%的牛蒡子苷、栀子苷、哈巴俄苷、苦杏仁苷、木犀草苷和西红花苷Ⅰ含量的对照品，水浴蒸干后用60%甲醇复溶，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 退热方中6 种苷类成分的加样回收率试验结果（n=9）Table 2 Results of recovery rate of six glycoside components in the Tuire Prescription（n=9）

2.5 样品含量测定按退热方处方量取3份样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密量取10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，测定结果见表3。

表3 退热方6 种苷类成分的含量测定结果（mg·g-1，n=3）Table 3 Results of content determination of six glycoside components in Tuire Prescription（mg·g-1，n=3）

2.6 网络药理学研究

2.6.1退热方苷类成分潜在作用靶点的获取 利用Pubchem 数据库获取6 个苷类成分的2D 结构信息与SMILES 格式文件，通过SWissTargetPrediction 数据库初步获得化学成分的靶点信息，将靶点信息整合、去重，共收集潜在作用靶点73个。

2.6.2疾病靶点的获取 以“流行性感冒（Influenza）”和“炎症（Inflammation）”为关键词，分别输入到GeneCards、DisGenet 和DrugBank 数据库进行检索，将上述数据库所获得的靶点经中位数筛选保留相关性较强的疾病靶点，合并去重，通过Uniprot 数据库进行规范，共获得疾病靶点6 221个。

2.6.3交集靶点与通路获取 利用Venny 2.1.0在线平台，共获得退热方中6个苷类成分与疾病的交集靶点54 个。通过DAVID 数据库对交集靶点进行KEGG 富集分析，选定物种为“Homo sapiens”，通过微生信网站将富集结果可视化。KEGG 通路富集分析图见图2。

图2 退热方苷类成分的KEGG 通路富集分析气泡图Figure 2 KEGG enrichment analysis bubble diagram of glycoside components in the Tuire Prescription

2.6.4退热方“苷类成分-靶点-疾病-信号通路”网络构建 将成分、靶点、疾病、通路信息汇总，利用Cytoscape 3.2.1进行网络构建，绘制网络药理学作用图。见图3。

图3 退热方“苷类成分-靶点-疾病-信号通路”网络Figure 3 The glycoside “components-targets-diseases-signaling pathways” network of Tuire Prescription

2.7 体外细胞实验验证

2.7.1统计学分析 采用GraphPad Prism 9.3.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析及LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.7.2细胞培养 将小鼠RAW264.7 单核巨噬细胞置于含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培养基中，在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行后续实验。

2.7.3MTT 法测定细胞的增殖能力 RAW264.7 细胞按照每孔5×105个·mL-1的密度接种于96 孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养过夜使贴壁，弃去上清。设置空白组（培养基）、对照组（细胞+培养基）、不同浓度给药组（5、10、20、40、100、200 μg·mL-1），每组平行6 孔。给药组加入不同浓度的含药培养基100 μL，空白组及对照组加入培养基100 μL，避光于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养24 h；每孔加入10 μL 浓度为5 mg·mL-1的MTT溶液，继续培养4 h；吸弃96孔板中溶液，每孔加入DMSO 150 μL；恒温振荡器上振荡20 min，用酶标仪于490 nm处测定其吸光度。细胞增殖活力=[OD（给药组）-OD（空白组）]/[OD（对照组）-OD（空白组）]×100%。

结果表明，与对照组比较，苦杏仁苷、栀子苷、西红花苷Ⅰ和哈巴俄苷给药组浓度在5～200 μg·mL-1范围内RAW264.7 细胞活力无明显变化（P＞0.05），牛蒡子苷给药组浓度在5～100 μg·mL-1范围内细胞活力无明显变化（P＞0.05）；木犀草苷给药组浓度在5～40 μg·mL-1范围内细胞活力显著提高（P＜0.05，P＜0.01）。见图4。根据各给药组细胞活力变化，综合考虑选择5、10、20 μg·mL-1的给药浓度进行后续研究。

图4 退热方6 种苷类成分对RAW264.7 细胞活力的影响Figure 4 Effect of six glycoside components in Tuire Prescription on RAW264.7 cell viability

2.7.4ELISA法检测细胞上清TNF-α的表达 RAW264.7细胞按每孔5×105个·mL-1的密度种于96 孔板中培养过夜，设置空白组、LPS模型组和各成分低、中、高剂量给药组（5、10、20 μg·mL-1）。空白组加入不含药物的培养基，模型组和给药组分别给予1 μg·mL-1LPS继续培养24 h，取上清培养液。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测各成分不同剂量组对TNF-α 释放的影响。结果见图5。与空白组比较，LPS 模型组TNF-α分泌水平显著增加（P＜0.001）；与LPS模型组比较，各成分给药剂量组TNF-α 分泌水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），说明退热方中6 种苷类成分对LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α释放均具有抑制作用。

图5 退热方6 种苷类成分对TNF-α 表达的影响Figure 5 Effects of six glycoside components in Tuire Prescription on TNF-α expression

2.7.5Griess 法检测细胞上清NO 水平 RAW264.7 细胞按5×105个·mL-1的密度接种于96 孔板，每孔500 μL 细胞悬液，培养过夜，吸弃上清，设置空白组、LPS 模型组和各成分低、中、高剂量给药组（5、10、20 μg·mL-1），每组3 个复孔。空白组加入不含药物的培养基，模型组和给药组分别给予1 μg·mL-1LPS 继续培养24 h，取上清培养液。按照NO 试剂盒说明书步骤操作，取50 μL上清液，分别加入50 μL GriessⅠ和50 μL Griess Ⅱ，用亚硝酸盐标准品配制系列浓度样品制作标准曲线，用酶标仪于540 nm 波长下测定OD 值，根据标准曲线计算各组NO 水平。结果见图6。

图6 退热方6 种苷类成分对NO 表达的影响Figure 6 Effects of six glycoside components in Tuire Prescription on NO expression

与空白组比较，LPS 模型组NO 分泌水平显著增加（P＜0.001）；与LPS模型组比较，各成分不同剂量组NO 分泌水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），表明退热方中6 种苷类成分对LPS 诱导的RAW264.7细胞释放NO具有抑制作用。

3 讨论

3.1 测定指标的选择退热方由荆芥穗、栀子、牛蒡子、生麻黄、杏仁、柴胡、青蒿、玄参8 味药组成，方中荆芥穗辛散微温，具有抗病毒、抗炎、镇痛作用[5]，佐以栀子、牛蒡子宣表邪、散郁热，生麻黄、杏仁宣肺平喘，柴胡、青蒿清热透邪，疏肝升阳，玄参有清热凉血补益之功。诸药配伍，达到清热解毒、解表散风的功效。由于中药疗效的产生是各成分之间协同作用的结果，只有从中医整体观出发，测定多种有效成分，才能更加科学、客观地评价中药质量。本研究通过查阅2020 年版《中国药典》等文献，探寻方中各药味抗炎抗病毒的有效成分、特征成分，并结合前期对退热方汤剂中所含化学成分的研究结果，初步确定退热方中木犀草苷、牛蒡子苷、哈巴俄苷、栀子苷、西红花苷Ⅰ和苦杏仁苷等6 种主要活性成分，并采用HPLC 法同时测定其含量。

荆芥穗和青蒿中所含的木犀草苷具有显著的抗炎、抗病毒作用[6-7]，可作为退热方测定指标之一。牛蒡子苷和哈巴俄苷是牛蒡子和玄参中的主要药效成分，具有抗炎、抗病毒、降血糖和增强免疫力等作用[8-9]。栀子主要药效成分为栀子苷和西红花苷Ⅰ，具有抗炎、抗氧化等作用[10，12]。苦杏仁苷是苦杏仁的特征成分，苦杏仁苷能显著抑制NF-κB 转录因子的激活，具有抗炎作用[13]，常被作为含量测定指标[14]。故本研究以这6种苷类成分为测定指标，建立同时测定其含量的HPLC法并进行方法学考察。

3.2 供试品溶液制备方法的考察本研究采用HPLC法同时测定退热方中6 种苷类成分的含量，以6 种成分提取率为考察指标，考察了不同加水量（6、8、10、12 倍），煎煮次数（1、2、3 次）及煎煮时间（10、20、30、40、50 min）对提取率的影响，最终确定该复方最佳水提工艺为10 倍量的水，煎煮2 次，每次20 min。同时，考察了退热方水煎液蒸干后复溶的溶剂，结果发现用60%甲醇复溶，各组分含量较高。

3.3 色谱条件的优化本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水流动相系统，并对不同浓度甲酸水（0.1%、0.2%）、磷酸水（0.1%、0.2%）以及纯水进行考察，结果显示，以甲醇-0.1%甲酸水为流动相，色谱峰形较为对称，出峰较好。本研究采用DAD 检测器进行全波长扫描，结果显示在254 nm 波长下，测得的各成分色谱峰值最高，峰型较好，重复性及分离效果最佳。

3.4 网络药理学结果分析采用网络药理学方法，构建“成分-靶点-疾病-信号通路”网络，筛选出与退热方发挥抗流感和抗炎作用相关的10 条通路、54 个基因。其中与癌症相关的通路有2 条（Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer），与病原体感染相关的通路有1 条（Hepatitis B），与免疫炎症反应相关的通路有7 条（MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、HIF-1 信号通路、IL-17 信号通路、NF-κB信号通路和钙信号通路）。

大量研究表明缺氧诱导因子1（HIF-1）通路是重要的炎症通路，在细菌感染和病毒感染中都已经检测到HIF-1α的表达。白细胞介素17（IL-17）是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可通过MAP 激酶途径和核转录因子κB（NF-κB）途径发挥其生物学作用介导炎症反应。MAPK 信号通路主要有ERK、JNK、p38/MAPK 等分支路线，与细胞炎症反应等密切相关。木犀草苷具有抗氧化和抗炎作用，能够通过调节MMP-2 表达和细胞外信号调节激酶（ERK）途径抑制人口腔癌细胞的迁移和侵袭[15]；Shi 等[16]发现木犀草苷能通过抑制IL-1β的表达和巨噬细胞的活化发挥抗炎镇痛作用。Zhang 等[17]发现栀子苷能通过降低EGFR/PI3K/AKT 通路活性和抑制钙信号通路发挥镇痛抗炎作用。Li等[18]报道牛蒡子苷通过下调MAPK和Akt 途径的激活，表现出有效的抗炎和抗过敏活性。哈巴俄苷能通过抑制LPS诱导的HepG2肝癌细胞中COX-2和iNOS的mRNA 水平以及蛋白质表达，进而抑制NF-κB 途径活化，发挥抗炎镇痛作用[19]。西红花苷Ⅰ主要通过调节NF-κB 通路和NF-κB p65 向细胞核的转运，从而抑制ROS 的产生和促炎细胞因子的分泌，减轻炎症反应[20]。苦杏仁苷可下调IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2因子水平起到抗炎作用。综上所述，退热方中6种苷类成分可能通过调节炎症反应、调节免疫、干预内分泌代谢等途径发挥抗炎、抗流感等药理活性。

3.5 体外细胞实验验证分析本研究利用LPS诱导建立RAW264.7 巨噬细胞炎症模型，采用MTT 法考察6 种苷类成分不同给药浓度对细胞增殖能力的影响。结果显示各成分组随着给药浓度的增加，细胞存活率均有所下降，且当给药浓度小于20 μg·mL-1时，细胞存活率无明显变化。因此，选择5、10、20 μg·mL-1的给药浓度实验。结果显示，与LPS 模型组比较，6 种苷类成分不同剂量给药组TNF-α 和NO 的水平均显著降低，且呈剂量依赖性，表明6种苷类成分具有明确的抗炎作用。结合网络药理学结果分析，退热方苷类成分可能通过MAPK、PI3K-Akt、NF-κB、IL-17等信号通路发挥抗炎作用。

本研究建立了HPLC 同时测定退热方中木犀草苷、牛蒡子苷、哈巴俄苷、栀子苷、西红花苷Ⅰ和苦杏仁苷6 种苷类成分的分析方法，该方法操作方便、准确可靠，稳定性和重现性良好。同时，初步探讨了6种苷类成分发挥抗流感、抗炎等功效的作用机制，体外细胞实验进一步验证了该复方中苷类成分具有抗炎作用，为揭示退热方药效作用的多成分、多靶点、多通路协同作用机制提供依据，为该方的质量控制和临床应用提供了理论支持。