王芳，刘清，高天慧，宋小妹（.陕西能源职业技术学院，陕西 咸阳 7000；.陕西中医药大学，陕西 咸阳 7046）

目前，全球2 型糖尿病（T2DM）患者数量逐年增加[1]，其病因复杂，与多种因素有关，胰岛素抵抗（IR）及胰岛β细胞功能缺陷被公认为是主要的发病机制。而氧化应激可以通过干扰磷脂酸肌醇3-激酶（PI3K）的活化转导和骨骼肌葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的转位等与胰岛素信号传递有关的生理活动，从而引发IR，与T2DM 的发生发展密切相关[2-4]。白虎加人参汤是《伤寒论》中的经典名方，具有养阴清热生津的功效，越来越多的临床研究[5-6]证明，白虎加人参汤能明显改善糖尿病患者的糖代谢异常、血脂紊乱、IR 等病理状态，同时还可以干预体内的炎症状态、氧化应激水平。白虎加人参汤加减方是在原方基础上去粳米加白术、茯苓、丹参组成，共奏益气养阴、健脾生津、活血化瘀之效。本课题组前期研究[7]发现，白虎加人参汤加减方可以减少T2DM 大鼠胰岛β 细胞凋亡，改善胰腺组织的病理变化，对胰岛细胞具有保护作用，其作用机制可能与调节PI3K/AKT/FoxO1 信号通路有关。故本研究拟继续探讨白虎加人参汤加减方对T2DM大鼠抗氧化应激作用机制及对GLUT4 表达的影响，以期阐明其治疗T2DM的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量（200±20）g，购自陕西中医药大学实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）2021-001。动物饲养于陕西中医药大学SPF级实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK（陕）2021-001；环境温度23 ℃左右，湿度（50±5）%，昼夜各半交替照明；大鼠适应性饲养1周后开始实验，期间自由摄食饮水。本实验经陕西中医药大学动物伦理委员会批准，批文号：SUCMDL20210611001。

1.2 药物及试剂白虎加人参汤加减方处方：知母10 g、石膏12 g、炙甘草6 g、西洋参8 g、白术6 g、茯苓6 g、丹参6 g，购自空军军医大学第一附属医院中药房，批号分别为：20210701、2107001、20210524、201201、20201201、20211102、201201。按组方比例称取药材，常规煎煮后浓缩至含生药量2.0 g·mL-1，4 ℃冰箱保存备用[7]。二甲双胍，上海施贵宝制药有限公司，批号：ABJ1186。链脲佐菌素（STZ），美国Sigma-Aldrich 公司，批号：S0130；高脂高糖饲料（繁殖鼠料54.6%、猪油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、预混料2.1%、麦芽糊精2.2%），上海普路腾生物科技有限公司，批号：20210621-074；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、胰岛素（INS）ELISA 检测试剂盒，均购自南京建成生物科技有限公司，批号分别为：A003-1-2、A005-1-2、A001-3-2、A003-1-2、H203-1-2；糖化血红蛋白（HbAlc）检测试剂盒，瑞士ALEXIS 公司，批号：YB-R0298c；Fyn 抗体，英国Abcam 公司，批号：ab184276； 蛋白激酶B（AKT）抗体、血红素加氧酶1（HO-1）抗体、GAPDH 抗体、GLUT4 抗体、p-AKT 抗体、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、p-GSK-3β 抗体、核因子NF-E2 相关因子（Nrf2）抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为：GB111114、GB12104、GB111114、GB112175、GB 13012-3、GB1311099、GB114582、GB113808；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox），宝生物工程（大连）有限公司，批号：AIG2018A；Trizol RNA 提取试剂盒，美国Ambion公司，批号：15596026。

1.3 主要仪器Free Sytle 血糖仪及血糖试纸，美国Abbott 公司；DYCZ-24DN 型双垂直电泳仪，北京六一仪器有限公司；1600型组织切片机，德国Leica 公司；Nanodrop 2000 型超微量核酸蛋白测定仪，美国Thermo Fisher 公司；IKA T10型高速组织匀浆机，德国IKA集团（广州）仪器设备有限公司；5417R型小型台式低温离心机，德国Eppendorf公司；7500 型实时荧光定量PCR 仪，美国ABI 公司；Nikon Eclipse 80i型倒置显微镜，日本Nikon公司；Synergy全自动多功能酶标仪，中国香港基因有限公司。

1.4 模型复制大鼠适应性饲养1 周后，随机选取8 只作为对照组，其余为造模组。对照组大鼠继续采用普通饲料喂养，造模组大鼠采用高脂高糖饲料喂养；4 周后，禁食不禁水12 h，造模组大鼠一次性腹腔注射STZ 40 mg·kg-1，对照组注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4.2）；72 h后，禁食不禁水12 h，测定大鼠空腹血糖（FBG）水平，2次FBG 值均大于11.0 mmol·L-1者为T2DM大鼠模型复制成功。

1.5 分组及给药将T2DM 大鼠随机分为4 组：模型组、阳性药组（二甲双胍，200 mg·kg-1）及白虎加人参汤加减方高、低剂量组（37.8、18.9 g·kg-1）[7]，每组8 只；给药组大鼠按照10 mL·kg-1灌胃给药，每日1 次，连续8 周；模型组、对照组灌胃等量0.5%CMC-Na溶液。模型组及给药组大鼠每天均给予高脂高糖饲料，对照组每天继续给予正常饲料。

1.6 生化指标检测（1）给药期间每2 周大鼠尾静脉取血1 次，测定FBG 值。给药8 周后，禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血；一部分血液保存于抗凝试管中，严格按照试剂盒说明书步骤测定HbAlc水平；另一部分血液在室温静置1 h 后，以3 000 r·min-1（离心半径15 cm）离心8 min，分离血清于-20 ℃保存，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，测定INS水平，计算：胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FBG×INS/22.5。（2）取大鼠胰腺组织约0.1 g，加入1 mL 提取液，进行冰浴匀浆；以4 ℃、8 000 r·min-1（离心半径15 cm）离心10 min，取上清，严格按照试剂盒说明书步骤操作，测定CAT、SOD、GSH-Px、MDA水平。

1.7 qRT-PCR 法检测肌肉组织中GLUT4 mRNA表达水平取大鼠肌肉组织100 mg，按照Trizol法提取总RNA，检测各样本RNA 含量和纯度；取1.0 μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书步骤操作，合成cDNA，逆转录反应条件：35 ℃、10 min，43 ℃、30 min，95 ℃、5 min，5 ℃、5 min。以cDNA 为模板进行PCR 扩增，引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，GLUT4上游引物序列：5'-GCCATGAGCT ACGTCTCCATT-3'，GLUT4 下游引物序列：5'-GGCCACGATGAACCAAGGAA-3'；GAPDH 上游引物序列：5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，GAPDH下游引物序列：5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'。PCR 反应条件：93 ℃、2 min；93 ℃、30 s，55 ℃、1 min，72 ℃、34 min，共40 个循环；60 ℃、2 min。根据扩增曲线读取Ct 值，以GAPDH 为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

1.8 Western Blot 法检测肌肉组织中GLUT4 蛋白及胰腺组织中AKT/GSK-3β/Nrf2 通路相关蛋白的表达情况取大鼠肌肉组织或胰腺组织100 mg，分别提取总蛋白和核蛋白（用于测定n-Nrf2、n-Fyn），经BCA 蛋白定量和蛋白变性后，进行SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜和封闭。封闭结束后，将PVDF 膜取出，在摇床上用TBST 洗5 遍，每次5 min；裁剪成合适条带，分别加入稀释后的p-GSK-3β、GSK-3β、p-AKT、AKT、Fyn、GLUT4、Nrf2、GAPDH 一抗（1∶1 000），充分覆盖PVDF膜，4 ℃下孵育过夜；次日在摇床上用TBST洗5遍，每次5 min，然后加入相应二抗（1∶5 000），室温下孵育1 h；在摇床上使用TBST 洗5 遍，每次5 min，采用ECL 化学发光液曝光、显影；扫描胶片，采用Alpha软件处理系统分析目标条带光密度值；以GAPDH 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.9 免疫组织化学法检测胰腺组织中HO-1、n-Nrf2蛋白表达取4%多聚甲醛溶液固定的胰腺组织，制备石蜡切片；脱蜡至水，EDTA 缓冲液修复，用5%BSA 在室温下封闭30 min；加入一抗HO-1（1∶400）、Nrf2（1∶400），4 ℃下孵育过夜；PBS洗涤后，加入二抗（1∶400），室温下孵育1.5 h；SABC 孵育1.5 h 后，滴加3，3-二氨基联苯胺显色；苏木素复染，水洗3 次，每次5 min；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜（×400）下随机选取3个视野，以棕黄色为阳性染色，采用Image-Pro Plus 5.0分析软件测定每个视野中的积分光密度（IOD）值，作为目的蛋白表达水平。

1.10 统计学处理方法采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白虎加人参汤加减方对T2DM 大鼠FBG、INS、HbAlc 及HOMA-IR 的影响结果见图1、表1。与对照组比较，模型组大鼠的FBG、HbAlc 及HOMA-IR 明显升高（P＜0.05），血清INS水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，给药组大鼠第4、6、8 周的FBG 水平及HbAlc、HOMA-IR 均明显降低（P＜0.05），阳性药组及白虎加人参汤加减方高剂量组大鼠的血清INS 水平明显升高（P＜0.05）。结果表明，白虎加人参汤加减方能够降低T2DM大鼠的血糖水平，改善IR。

表1 白虎加人参汤加减方对2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的影响（±s，n=8）Table 1 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on HOMA-IR in T2DM rats（±s，n=8）

表1 白虎加人参汤加减方对2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的影响（±s，n=8）Table 1 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on HOMA-IR in T2DM rats（±s，n=8）

注：与对照组比较，#P＜0.05 ；与模型组比较，*P＜0.05

HOMA-IR 4.88±1.10 12.69±3.32#8.96±1.91*8.54±2.18*8.98±2.49*组别对照组模型组阳性药组白虎加人参汤加减方高剂量组白虎加人参汤加减方低剂量组剂量/（g·kg-1）--37.8 18.9 200 mg·kg-1

图1 白虎加人参汤加减方对2 型糖尿病大鼠空腹血糖、胰岛素、糖化血红蛋白水平的影响（±s，n=8）Figure 1 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on FBG，INS and HbAlc levels in T2DM rats（±s，n=8）

2.2 白虎加人参汤加减方对T2DM 大鼠抗氧化应激水平的影响结果见图2。与对照组比较，模型组大鼠胰腺组织的CAT、SOD、GSH-Px 水平均明显降低（P＜0.05），MDA 水平明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，给药组大鼠胰腺组织的CAT、SOD水平均明显升高（P＜0.05）；阳性药组及白虎加人参汤加减方高剂量组大鼠腺组织的GSH-Px 水平明显升高（P＜0.05），MDA水平明显降低（P＜0.05）。结果表明，白虎加人参汤加减方能够提高T2DM大鼠的抗氧化应激水平。

图2 白虎加人参汤加减方对2 型糖尿病大鼠抗氧化应激水平的影响（±s，n=8）Figure 2 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on anti-oxidative stress in T2DM rats（±s，n=8）

2.3 白虎加人参汤加减方对T2DM 大鼠肌肉组织中GLUT4 表达的影响结果见图3。与对照组比较，模型组大鼠肌肉组织中GLUT4 蛋白及mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，给药组大鼠肌肉组织中GLUT4 蛋白及mRNA 表达水平均明显升高（P＜0.05）。

图3 白虎加人参汤加减方对2 型糖尿病大鼠肌肉组织中GLUT4 表达的影响（±s，n=8）Figure 3 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on expression of GLUT4 in T2DM rats（±s，n=8）

2.4 白虎加人参汤加减方对T2DM 大鼠胰腺组织中AKT/GSK-3β/Nrf2 通路相关蛋白表达的影响结果见图4 。与对照组比较，模型组中大鼠胰腺组织中的p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），n-Nrf2、n-Fyn、HO-1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，给药组大鼠胰腺组织中的p-AKT/AKT、n-Nrf2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），n-Fyn 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；阳性药组及白虎加人参汤加减方高剂量组大鼠胰腺组织中的p-GSK-3β/GSK-3β、HO-1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。

图4 白虎加人参汤加减方对2 型糖尿病大鼠胰腺组织中AKT/GSK-3β/Nrf2 通路相关蛋白表达的影响（±s，n=8）Figure 4 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on expression of AKT/GSK-3β/Nrf2-related proteins in T2DM rats（±s，n=8）

3 讨论

在2 型糖尿病（T2DM）研究中，利用高脂高糖饲料饲养数周后再联合注射小剂量STZ诱导的T2DM大鼠模型是目前被广泛认可并应用的一类T2DM动物模型[8]。造模时首先通过给大鼠长期喂养高脂高糖饲料以造成胰岛素抵抗（IR），然后再联合注射小剂量STZ可破坏胰岛β细胞，旨在模拟人类T2DM的自然病理过程[8-9]。本实验结果显示，模型组大鼠的FBG、HbAlc 及HOMA-IR 明显升高，血清INS 水平明显降低，该方法所建立的T2DM 模型成模率高，T2DM 特征明显，稳定性较好，且死亡率低。

临床上T2DM 患者常伴随着IR 和胰岛β 细胞受损，造成INS 分泌减少或相对不足，引起FBG 升高。FBG是糖尿病的主要诊断指标，而HbAlc常作为反映血糖控制水平的主要指标。本研究结果显示，给予白虎加人参汤加减方干预后，模型组大鼠的FBG 水平及HbAlc、HOMA-IR 均明显降低，血清INS 水平明显升高，表明白虎加人参汤加减方能够降低T2DM大鼠的血糖水平，改善IR。

IR和胰岛β细胞功能缺陷被认为是T2DM发病的重要病理生理机制[10]，而氧化应激可以通过干扰PI3K 活化转导和GLUT4 转位等与胰岛素信号传递有关的生理活动而引发IR[2-4]。研究[11]发现，GLUT4 表达下调、转位障碍是IR 发病机制中的主要因素，GLUT4 作为一种膜蛋白主要分布在细胞内，正常状态下胰岛素效应器官中的GLUT4 会从胞内转至细胞膜上，从而协助葡萄糖进入细胞及合成糖原，而在T2DM中该作用会被大大减弱。本研究结果显示，白虎加人参汤加减方能够改善T2DM大鼠的IR，明显降低HOMA-IR值，可能与上调GLUT4表达密切相关。

当机体长期处于高血糖状态，会在体内引起氧化应激，活性氧（ROS）异常增高，过量的ROS可启动细胞线粒体凋亡程序，从而引发胰岛β 细胞凋亡[12-14]。正常状态下，可通过GSH-Px、SOD、CAT 等抗氧化酶来清除机体自由基和过氧化物，但是在T2DM中机体处于氧化应激状态，脂质过氧化的降解产物MDA增多，抗氧化酶减少，导致机体ROS 大量形成，引起胰岛β 细胞凋亡，导致IR 加重。本研究结果显示，白虎加人参汤加减方能够提高T2DM大鼠胰腺组织中SOD、GSH-Px 及CAT 水平，并降低MDA 水平，表明其能提高T2DM大鼠的抗氧化应激水平。

Nrf2/ARE 通路是细胞内重要的内源性抗氧化防御机制之一，而PI3K/AKT 信号通路广泛参与了Nrf2的活化和核移位过程[15]。PI3K 通过磷酸化来活化AKT，活化的AKT进一步诱导GSK-3β磷酸化，从而抑制其活性，磷酸化GSK-3β可以降低Nrf2负向调节因子Fyn的核内转移，减少Nrf2出核，使其在细胞核内与ARE 结合，进而诱导一系列抗氧化酶如HO-1、NQO-1 等的表达，对机体发挥抗氧化应激作用[16-17]。本研究结果显示，白虎加人参汤加减方能够明显上调T2DM 大鼠胰腺组织中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β 蛋白表达，下调n-Fyn 蛋白表达，从而使下游分子n-Nrf2、HO-1蛋白表达明显上调。因此，初步推测白虎加人参汤加减方可能是通过调控AKT/GSK-3β/Nrf2 通路来发挥对T2DM 大鼠的抗氧化应激作用（见图5）。

图5 白虎加人参汤调控AKT/GSK-3β/Nrf2 通路对2 型糖尿病大鼠的抗氧化应激作用机制示意图Figure 5 Schematic diagram of anti-oxidative stress mechanism of AKT/GSK-3β/Nrf2 pathway regulated by Modified Baihu Plus Renshen Decoction on T2DM rats

综上所述，白虎加人参汤加减方可以降低T2DM大鼠的FBG、HbAlc、HOMA-IR 水平，促进INS 分泌，改善IR，可能与其上调骨骼肌GLUT4 表达密切相关；白虎加人参汤加减方还能够提高T2DM大鼠胰腺组织中SOD、GSH-Px 及CAT 水平，降低MDA 水平，可能通过调控AKT/GSK-3β/Nrf2 通路来发挥抗氧化应激作用。但其缓解IR的作用是否与PI3K/AKT信号通路有关，有待进一步探讨。