张汗顺，余功，郑鸿翔，谢斌（江西中医药大学，江西 南昌 330004）

肺癌死亡率居恶性肿瘤首位[1]，尽管采取手术治疗、放化疗等多种综合治疗手段，其5年生存率也仅为20%左右[2]。中医药在肺癌治疗中具有独特优势[3]，可减轻放化疗副反应并增强其疗效，调节机体免疫力，促进术后恢复，改善患者生存质量，延长生存期。清燥救肺汤出自清代名医喻嘉言的《医门法律》，常用于肺癌的临床治疗。研究表明，清燥救肺汤能抑制中晚期非小细胞肺癌化疗患者的肿瘤标志物和细胞因子表达，并改善其生存期、生活质量及生存率[4]；清燥救肺汤还能够升高肺癌放射性肺损伤患者的氧分压，降低C 反应蛋白（CRP）、转化生长因子β1（TGF-β1）水平，改善其肺功能，降低肺损伤[5-6]。

本课题组前期研究[7]表明，清燥救肺汤可显著抑制Lewis 肺癌细胞增殖，可能与抑制细胞色素C 氧化酶亚单位Ⅳ（COX Ⅳ）蛋白表达，降低三磷酸腺苷（ATP）生成，继而升高一磷酸腺苷（AMP）/ATP 比值有关。ATP 生成减少，相对AMP 增多，升高AMP/ATP 比值能够激活能量感受器腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），可诱导自噬的发生[8]。进一步研究[9]发现，清燥救肺汤能有效促进Lewis荷瘤小鼠肺癌细胞自噬溶酶体生成，其诱导自噬启动机制是通过激活AMPK，直接磷酸化UNC-51 样激酶1（ULK1）蛋白，从而诱导肺癌细胞自噬启动。本研究拟进一步结合AMPK抑制剂观察清燥救肺汤对肺癌细胞自噬体膜及溶酶体形成相关蛋白表达的影响。

1 材料

1.1 动物及瘤株SPF级雄性C57BL/6J小鼠50只，体质量（20±2）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003，动物质量合格证号：1107261911004575。小鼠Lewis 肺癌细胞，购自美国菌种保藏中心（ATCC）细胞库，编号：36470TM。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审批，批准文号：JZLLSC20210014。

1.2 药物清燥救肺汤处方：枇杷叶9 g、党参12 g、生石膏12 g、霜桑叶9 g、炙阿胶9 g、苦杏仁9 g、麦冬10 g、甘草3 g，上述药物均购自江西省中医院，由江西中医药大学国家工程中心冯育林教授鉴定均为正品。按照前期研究[9]方法制备成清燥救肺汤干粉。阳性对照药物为环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药公司，批号：9L351A。

1.3 试剂Compound C（AMPK抑制剂）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na），美国MCE 公司，批号：79767、66038；全蛋白抽提试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒、预染蛋白Marker、兔抗GAPDH 抗体、羊抗兔IgG-HRP 二抗、免疫组化笔、DAPI 染色试剂盒，均购自江苏凯基生物技术公司，批号：20210111、20210126、20210115、20210121、20210115、20210222、20200727；兔抗磷酸化自噬关键分子酵母ATG6同系物（p-Beclin-1）抗体，美国CST 公司，批号：1；兔抗自噬关键分子酵母ATG6 同系物（Beclin-1）、III 型磷脂酰肌醇3-激酶（VPS34）、自噬蛋白微管相关蛋白轻链3B（LC3B）抗体，英国Abcam 公司，批号：GR319837、GR155536-1、GR321382；兔抗磷酸化III 型磷脂酰肌醇3-激酶（p-VPS34）抗体，美国Invitrogen 公司，批号：33591A03；兔抗P62 抗体，武汉三鹰生物技术公司，批号：00082587；ULtrapur-RNA Kit 超纯RNA 提取试剂盒、HIFIScript cDNA 第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixyture 实时荧光定量PCR 预混体系，北京康为世纪生物公司，批号：34920、36320、35320。

1.4 主要仪器Power Supplies Basic 电泳仪、Trans-Blot Turbo 全能型蛋白转印系统，美国Bio-Rad 公司；G：BOXChemiXR5 型凝胶成像系统，英国SYNGENE 公司；SpectraMaxM3 型多功能酶标仪，美国MD公司；UV752型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器公司；XW-80A 型LongGeneRNA 逆转录仪，上海青浦沪西仪器厂；AFD9600 型荧光定量PCR仪，杭州安杰思医学科技公司；BX43 型生物正置显微镜、VS200 型数字病理切片扫描仪，日本Olympus公司。

2 方法

2.1 模型复制Lewis 肺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，培养环境为37 ℃、5% CO2。取生长状态良好的Lewis 肺癌细胞，以每只1×106个的浓度无菌接种于小鼠右腋皮下[9]。

2.2 分组及给药将50只小鼠随机分为模型组、CTX组、清燥救肺汤组、AMPK 抑制剂组、清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组，每组10 只。清燥救肺汤组和清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组需造模前14 d 开始灌胃清燥救肺汤（11 g·kg-1·d-1），其余各组小鼠正常饲养，清燥救肺汤给药剂量依据前期研究[9]结果设定。各组小鼠造模24 h后，模型组以等体积生理盐水灌胃；CTX组以50 mg·kg-1CTX 隔日腹腔注射1 次，共7 次；AMPK 抑制剂组和清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组均腹腔注射Compound C（10 mg·kg-1·d-1）；清燥救肺汤组、清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组继续按照设定剂量灌胃给药；各组小鼠给药时间均为14 d。

2.3 Western Blot 法检测肺癌组织自噬体膜形成相关蛋白的表达水平取50 mg肿瘤组织，加入蛋白裂解液，冰上匀浆；离心后取上清，采用BCA 法测定总蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳分离蛋白后转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭总蛋白，5% BSA 封闭磷酸化蛋白；加入一抗p-Beclin-1（1∶1 000）、p-VPS34（1∶1 000）、Beclin-1（1∶2 000）、VPS34（1∶6 000）、GAPDH（1∶6 000），4 ℃下孵育过夜； 洗膜后加入二抗（1∶8 000），室温下孵育2 h；显影并扫描。采用ImageJ 图像分析软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

2.4 RT-qPCR 法检测肺癌组织中自噬相关蛋白9A（ATG9A）、乙酰辅酶A 合成酶2（ACSS2）、转录因子增强子3（TFE3）mRNA 的表达水平取50 mg肿瘤组织，加入1 mL TRIzon试剂提取总RNA；检测各样本RNA含量和纯度。采用第一链cDNA合成试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，逆转录反应条件：42 ℃、15 min，85 ℃、5 min。每个样本取1 μg cDNA，用UltraSYBR Mixyture 试剂盒配制成50 μL 反应体系，PCR 反应条件：95 ℃、10 s 预变性，95 ℃、5 s 变性，60 ℃、15 s 退火，2 ℃、30 s 延伸，共40 个循环。熔解曲线程序：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。通过扩增曲线和熔解曲线确定引物的特异性；以GAPDH 为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。引物由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1。

2.5 免疫荧光双重染色法检测肺癌组织中LC3B、P62 蛋白表达情况取适量冰冻肺癌组织，制成厚度约4～5 μm 切片，浸入1%丙酮固定液；每张切片滴加2 滴3% H2O2-甲醇溶液灭活酶；用1% BSA 50～100 μL 封闭后，滴加50～100 μL 一抗（1∶100）；滴加50～100 μL FITC/TRITC（1∶200）二抗；每张切片滴加50～100 μL DAPI 染液后，用防淬灭封片胶封片；采用数字病理切片扫描仪扫片，分析红色荧光（LC3B）和绿色荧光（P62）的表达强度（IOD/Area），进行半定量分析。

2.6 统计学处理方法采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中Beclin-1、p-Beclin-1 蛋白表达的影响结果见图1。与模型组比较，清燥救肺汤组和CTX 组小鼠肺癌组织中Beclin-1、p-Beclin-1蛋白表达水平及p-Beclin-1/Beclin-1 比值显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。与清燥救肺汤组比较，清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组小鼠肺癌组织中p-Beclin-1 蛋白表达水平及p-Beclin-1/Beclin-1 比值显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与AMPK 抑制剂组比较，清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组小鼠肺癌组织中Beclin-1、p-Beclin-1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。

图1 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中Beclin-1、p-Beclin-1 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 1 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the protein expressions of Beclin-1 and p-Beclin-1 in lung cancer tissues of Lewis tumor-bearing mice（±s，n=3）

3.2 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中VPS34、p-VPS34 蛋白表达的影响结果见图2。与模型组比较，清燥救肺汤组和CTX 组小鼠肺癌组织中VPS34、p-VPS34 蛋白表达水平及p-VPS34/VPS34比值均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。与清燥救肺汤组比较，清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组小鼠肺癌组织中VPS34、p-VPS34 蛋白表达水平及p-VPS34/VPS34比值均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与AMPK 抑制剂组比较，清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组小鼠肺癌组织中VPS34、p-VPS34 蛋白表达水平及p-VPS34/VPS34比值均显著升高（P＜0.01）。

图2 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中VPS34、p-VPS34 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 2 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the protein expressions of VPS34 and p-VPS34 in lung cancer tissues of Lewis tumorbearing mice（±s，n=3）

3.3 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中ATG9A、ACSS2、TFE3 mRNA 表达的影响结果见图3。与模型组比较，清燥救肺汤组和CTX组小鼠肺癌组织中ATG9A、ACSS2 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01），TFE3 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.01）。与清燥救肺汤组比较，清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组小鼠肺癌组织中ATG9A、ACSS2 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），TFE3 mRNA 表达水平显著上升（P＜0.01）。与AMPK抑制剂组比较，清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组小鼠肺癌组织中ATG9A、ACSS2 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中ATG9A、ACSS2、TFE3 mRNA 表达的影响（±s，n=3）Figure 3 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the mRNA expressions of ATG9A，ACSS2 and TFE3 in lung cancer tissues of Lewis tumor-bearing mice（±s，n=3）

3.4 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中LC3B、P62 蛋白表达的影响结果见图4。与模型组比较，清燥救肺汤组和CTX 组小鼠肺癌组织中LC3B 蛋白荧光强度表达水平显著升高（P＜0.01），P62 蛋白荧光强度表达水平显著降低（P＜0.01）。与清燥救肺汤组比较，清燥救肺汤+AMPK 抑制剂组小鼠肺癌组织中LC3B蛋白荧光强度表达水平显著降低（P＜0.01），P62 蛋白荧光强度表达水平明显升高（P＜0.05）。

图4 清燥救肺汤对Lewis 荷瘤小鼠肺癌组织中LC3B、P62 蛋白表达的影响（免疫荧光，×200；±s，n=3）Figure 4 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the protein expressions of LC3B and P62 in lung cancer tissues of Lewis tumor-bearing mice（IF，×200；±s，n=3）

4 讨论

肺癌属于中医学“肺痿”的范畴，燥热伤肺是其重要病机[10]。清燥救肺汤具有清燥润肺、益气养阴的功效，方中霜桑叶为君，与臣药生石膏配伍，清泄肺热；佐以麦冬、人参和阿胶补气养阴，杏仁、枇杷叶宣肺止咳；炙甘草调和诸药为使。诸药合用，体现了方剂“宣、清、润、降”四法并施，补泻并用的特点，主治温燥伤肺证，与肺癌放化疗后的燥热病机相符。临床上清燥救肺汤联合化疗药物治疗非小细胞型肺癌，能有效改善其临床咳嗽等症状，提高患者免疫力[11]。

通过对清燥救肺汤抗肺癌机制的深入研究发现，其能降低肺癌细胞内核转录因子κB（NF-κB）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达，减少肺癌细胞的增殖迁移[12]；能通过降低糖酵解能量代谢途径的关键限速酶的活性，抑制能量代谢途径，减少肿瘤细胞生成，发挥抗癌功效[13]；还能抑制肺癌磷酸戊糖能量代谢途径的关键酶活性，并影响其调控因子，抑制肺癌细胞增殖[14]；通过抑制转化生长因子的过度表达，实现延缓肺癌发生发展及转移的目的[15]。上述基础实验证实，清燥救肺汤发挥抗肺癌作用机制与其“清热润燥”功效相契合，通过抑制能量代谢限速酶活性，减少ATP的生成，达到“清热”之功效。

本课题组在前期研究[9]中发现，清燥救肺汤能升高肺癌细胞自噬启动相关蛋白AMPK、ULK1 蛋白磷酸化，降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）磷酸化表达；加入AMPK 抑制剂后，AMPK、ULK1 蛋白磷酸化水平明显降低，mTOR 蛋白磷酸化无明显变化，表明清燥救肺汤可能是通过激活AMPK、直接磷酸化ULK1来诱导肺癌细胞自噬。结合清燥救肺汤抗肺癌其他相关实验研究表明，其能显著抑制肺癌细胞氧化磷酸化[7]、糖酵解[14]、磷酸戊糖途径代谢限速酶活性[15]等多靶点发挥抗肺癌作用。因此，阻止癌细胞利用糖原脂类核苷酸等原料获取能量，既能诱导癌细胞自噬促进其降解，又能抑制其对降解产物的利用，可能是清燥救肺汤发挥抗肺癌作用的机制。

自噬是细胞内一种进化上高度保守的代谢途径，通过溶酶体将一些错误折叠的蛋白及衰老损伤的细胞器进行降解。自噬发生时，首先在细胞质中会形成一种双层膜包裹的囊泡结构即自噬体，然后自噬体与溶酶体发生融合，形成自噬溶酶体[16]。其中，自噬体膜的形成、延伸以及溶酶体生成是自噬形成过程中的关键步骤。

近年来大量研究[17]表明，在细胞处于低能量水平时，ATP 生成减少，相应AMP/ATP 比值升高，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激活，抑制mTOR 活性，通过mTOR 依赖途径调节自噬的发生，并可通过ULK1的磷酸化直接调节自噬。其中AMPK信号通路自噬核心组分ATG9A、VPS34和Beclin-1蛋白表达升高，促进自噬体膜形成及延伸[18-19]。VPS34、Beclin-1 蛋白通过募集大量ATG 蛋白定位于自噬小体，协助膜和脂质体构形改变从而诱导自噬小体生成[20]。ATG9A是一种跨膜蛋白，表达升高能有效促进自噬体延伸的囊泡参与自噬体生物合成，AMPK同样也可特异性磷酸化ATG9A来影响自噬活性[21]。

溶酶体生成关键因子ACSS2可通过乙酰辅酶A的形成和随后的蛋白质乙酰化的方式调节自噬，当细胞内缺乏能量时，AMPK介导的ACSS2在丝氨酸残基S659处磷酸化，随后核定位的ACSS2与转录因子EB（Transcription factor EB，TFEB）结合，并移位至溶酶体和自噬基因启动子区域，结合组蛋白乙酰化周转产生的乙酸酯，在这些区域局部产生乙酰辅酶A，从而促进溶酶体形成[22]。TFE3 能上调多个自噬发生相关基因的转录水平，可能的基因包括ATG5、ATG16L和LC3等，进而促进溶酶体的合成，TFE3过表达时细胞的自噬水平也显著升高，同样细胞的自噬水平会随TFE3表达下调而降低[23]。

LC3B 为哺乳动物自噬发生的标志蛋白，有LC3B-I、LC3B-Ⅱ两种存在形式，LC3B-Ⅱ蛋白定位于自噬小体内外膜上，识别P62蛋白标记的待降解底物，统一运送到自噬溶酶体中降解[24]。LC3B-Ⅱ蛋白表达上调，同时P62蛋白表达下调，表示自噬活性上升，反之则自噬活性受到抑制。

本实验结果显示，清燥救肺汤加入AMPK抑制剂后，VPS34、p-VPS34、p-Beclin-1 蛋白表达水平降低，ATG9A、ACSS2 mRNA 表达下调，TFE3 mRNA表达上调，LC3B 蛋白荧光强度表达水平降低，P62蛋白荧光强度表达水平升高。结合前期清燥救肺汤诱导自噬启动机制研究[9]结果表明，清燥救肺汤诱导肺癌细胞自噬溶酶体生成的机制可能是通过激活AMPK，磷酸化自噬启动子ULK1，进一步激活Beclin-1与VPS34复合体，募集ATG蛋白质到自噬体组装位点，上调ATG9A mRNA 表达，继而促进脂质转运，将自噬体延伸所需要的膜结构转运至自噬囊泡，促进LC3B-I 向LC3B-Ⅱ蛋白转化，下调P62 蛋白表达，促进自噬小体生成，同时促进ACSS2 mRNA 表达水平升高，降低TFE3 mRNA 表达水平，从而诱导肺癌细胞自噬小体与溶酶体融合，生成自噬溶酶体，诱导肺癌细胞自噬。

综上所述，清燥救肺汤诱导肺癌细胞自噬体膜及溶酶体形成的机制可能是通过激活Beclin-1、VPS34蛋白，上调ATG9A、ACSS2 mRNA 表达，抑制TFE3 mRNA表达实现的。