方欢乐，陈衍斌，张鑫，刘小溪，周亚明，杜霞（.西安培华学院医学院，陕西 西安 705；.陕西步长制药有限公司科研部，陕西 西安 70075；.陕西省中医药研究院，陕西 西安 7000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是诱发缺血性心脏病、心肌梗死和中风等多种严重心血管疾病的病理基础，危害着人类健康[1]。AS 发病机制十分复杂，主要与脂质代谢紊乱、氧化应激、内皮细胞的损伤、平滑肌细胞的增殖和迁移等相关[2-3]。目前临床以西药治疗为主，这些药物尽管疗效确切但往往伴随着较大的副作用[4]。近年来，中医药在动脉粥样硬化的治疗中凸显出越来越重要的作用。

动脉粥样硬化，属于中医学“胸痹”“脉痹”“中风”“厥心痛”等病证范畴。因此，中医多从化瘀、补气、祛痰、活血等来干预[5]。桃仁与红花配伍源自《医宗金鉴》，是活血化瘀经典而常用的药对之一[6]。桃仁破血祛瘀，其含有苷类、脂类、苦杏仁酶等可扩张血管、增加器官血流量、抗血栓、促纤溶等作用[7]；红花活血化瘀，含有红花色素、红花苷、肉豆蔻酸、多糖等，具有抑制血小板聚集、改善血流变、降脂等作用[8]。研究[9]显示，桃仁∶红花= 1∶1（占使用桃仁、红花方剂总数的53.4%）可很好地改善心脑血管疾病。但目前关于桃仁-红花改善AS 的作用机制研究还较少。

本研究拟采用网络药理学从多靶点、多角度、多途径揭示桃仁-红花药对治疗AS 的潜在分子机制，并通过分子对接结合动物实验验证桃仁-红花药对（1∶1）不同剂量改善AS的作用，以期为桃仁-红花药对的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 桃仁-红花药对化学成分数据库及靶标识别采用TCMIP v2.0 平台，在“中药材数据库”模块检索桃仁、红花的所有化学成分，构建桃仁-红花药对化学成分数据库；利用TCMIP v2.0 平台中嵌套的MedChem Studio 软件，基于分子相似性原理进行靶标识别，即将待测化合物与DrugBank 数据库中的已知药物进行二维结构相似性比较，以Tanimoto系数表征分子相似性分值，当Tanimoto相似性≥0.8，则已知药物的作用靶标即作为待测化合物的作用靶标，以此获得桃仁-红花所有化学成分作用的靶标。

1.2 动脉粥样硬化疾病靶标收集利用TCMIP v2.0平台“疾病相关分子库”并结合人类基因数据库GeneCards（score＞1），以“atherosclerosis”为检索关键词，获取动脉粥样硬化相关的疾病基因信息。

1.3 干预动脉粥样硬化潜在作用靶标分析采用易汉博生物信息在线作图（imageGP）平台的VennDiagram plot 工具，将桃仁-红花化学成分作用的靶标与动脉粥样硬化疾病靶标进行交集映射，获得桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的潜在作用靶标。

1.4 蛋白互作网络（PPI）构建及核心靶标筛选将上述交集靶标导入STRING 平台，置信度设为0.7，获得PPI 网络数据，导入Cytoscape 3.7.1 软件进行可视化。利用该软件的CytoNCA 插件进行网络特征值分析，以拓扑结构特征度中心性（degree centrality）大于中位数的网络节点作为桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的核心网络靶标。

1.5 基因本体（GO）和KEGG 通路富集分析利用KOBAS 在线平台对上述关键网络靶标进行GO 和KEGG 通路富集分析，获得桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的关键靶标蛋白在基因功能和信号通路中的作用。通过KEGG 通路数据库中的分类明确桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的核心作用靶标富集的通路类型，去掉“癌症”等与动脉粥样硬化无关的疾病通路，其余通路以P值为参考，P值越小，可信度越高。最后，借助微生信（bioinforamtics）在线绘图平台绘制GO和KEGG通路富集图。

1.6 “药材-化合物-核心靶标-作用通路”多维关联网络构建与分析采用Cytoscape软件构建“药材-化合物-核心靶标-作用通路”多维关联网络，并使用插件NetworkAnalyzer 分析网络的拓扑性质，包括：度中心性（Degree centrality）、介数中心性（Betweeness centrality）和紧密中心性（Closeness centrality），根据这三种拓扑特征值，以中位数为卡值，以同时满足两者以上为条件筛选出关键化合物、关键核心靶标及关键作用通路。

1.7 分子对接分析筛选部分关键化合物和关键核心靶标，从PubChem 数据库获取关键化合物的结构文件，从PDB 数据库获取关键靶标的结构文件。采用AutoDock 进行分子对接验证。利用结合能评估关键化合物与靶标之间的结合能力。

1.8 动物实验验证

1.8.1实验动物 C57BL/6 雄性8 周龄小鼠，体质量（20± 2）g；ApoE-/-雄性8 周龄小鼠，体质量（20±2）g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（苏）2021-0013，质量合格证号：202106004。动物饲养于温度18～23 ℃，湿度50%～60%，自由摄食、饮水。本实验经陕西省中医药研究院实验动物伦理委员会批准，批准号为：（2022）动物伦审第（14）号。

1.8.2高脂饲料、药物及试剂 高脂饲料（配方为胆固醇0.15%、脂肪21%、基础饲料78.85%）购于北京博泰宏达生物技术有限公司；桃仁、红花购自陕西兴盛德药业有限责任公司，批号分别为：20220101、20220301；辛伐他汀片，涿州东乐制药有限公司，批号：201004；总胆固醇（TC，批号：20210510）、甘油三脂（TG，批号：20210508）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，批号：20210510）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C，批号：20210508）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素6（IL-6，批号：20210608）、肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号：20210621）ELASA试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；兔多克隆抗体TLR4 抗体，美国Abcam公司，批号：ab13556；鼠多克隆抗体NF-κB、鼠多克隆抗体P-NF-κB、兔多克隆抗体AKT、兔多克隆抗体P-AKT、鼠多克隆抗体GAPDH抗体，均由美国Immunoway 公司提供，批号分别为：YM3111、YM3224、YT0185、YT0134、YM3029。

1.8.3桃仁、红花（1∶1）水煎液的制备 取桃仁、红花各15 g，倒入300 mL 的蒸馏水中，煎煮2 次，合并滤液，浓缩至2.58 g·kg-1备用。

1.8.4仪器 JA10003B大量程电子精密天平，上海精密仪器公司；H-1600A 台式离心机，江东仪器公司；Heraeus Fresco 17冷冻高速离心机、1510全自动酶标仪，美国Thermo 公司；PowerPacTM Basic 电泳、Universal Hood III 发光设备，美国Bio-Red 公司；ECLIPSE Ci-L正置显微镜，日本NIKON公司。

1.8.5实验分组及给药方法 10 只C57BL/6 雄性小鼠为正常组，50 只ApoE-/-雄性小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组（0.002 5 g·kg-1）及桃仁-红花（1∶1）低、中、高剂量组，每组10 只。桃仁-红花（1∶1）给药剂量根据相关研究[10]使用的大鼠用药剂量，结合大鼠与小鼠用药剂量换算比例1∶1.4 进行换算，得到小鼠低、中、高剂量组给药剂量为1.30、1.94、2.58 g·kg-1。动物适应性生长1 周，在实验期间自由摄食和水。1 周后正常组普通饮食、每日灌胃等量生理盐水，模型及给药组高脂饲料喂养8 周复制动脉粥样硬化模型[11]。4 周后给药，模型组每天灌胃等体积生理盐水；桃仁-红花（1∶1）低、中、高剂量组及辛伐他汀组每天给高脂饲料同时灌胃给药1次，灌胃体积均为10 mL·kg-1，连续灌胃给药8 周。实验结束前禁食不禁水12 h，摘眼球取血，血液离心做血清学检测；小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下解剖ApoE-/-小鼠，取下小鼠主动脉，仔细剥除结缔组织，用生理盐水冲洗干净后，取部分组织用4%多聚甲醛浸泡做HE染色，剩余组织于-80 ℃冻存。

1.8.6HE 染色观察主动脉血管形态 将固定完全的主动脉进行常规石蜡包埋，连续4 μm厚度切片，HE染色，镜下观察。

1.8.7生化指标的测定 小鼠血液以3 500 r·min-1离心（离心半径12 cm）20 min，分离血清，应用全自动酶标仪测定各组血清TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量。具体操作按试剂盒说明书完成。

1.8.8酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定TNF-α、IL-6 含量 将各组小鼠血清采用双抗体夹心ABCELISA法测定TNF-α、IL-6的浓度。实验操作步骤按试剂盒说明书方法进行。

1.8.9蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测血管组织TLR4、NF-κB、AKT 蛋白表达 取-80 ℃保存的血管组织100 mg，进行组织裂解，4 ℃离心，100 ℃变性后保存备用。用8%SDS-多聚酰胺凝胶电泳分离，湿法转移蛋白到PVDF 膜上，室温封闭1 h 后，分别加入特异性一抗TLR4（1∶500）、NF-κB（1∶500）、PNF-κB（1∶500）、P-AKT（1∶500）、AKT（1∶500）、GAPDH（1∶2 000）孵育，4 ℃过夜。用TBST 洗膜5 次后与二抗结合（抗鼠或抗兔1∶5 000）室温孵育1 h后，TBST洗膜5次。条带用增强化学发光（ECL）试剂（Millipore）发光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 software分析。

1.9 统计学处理方法采用SPSS 16.0 统计软件，计量资料结果以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桃仁-红花药对化学成分及靶标预测结果在TCMIP v2.0 平台“中药材数据库”模块分别检索“桃仁”和“红花”，共收集到49 个化合物，其中桃仁共3 个化合物，分别为：儿茶素、α-蒎烯和Methyl-α-D-Fructofuranoside；红花包含46 个化合物，主要为黄酮类、脂肪酸类、聚炔类和其他类化合物。靶标识别结果显示，桃仁所含成分作用靶标共有53 个，红花所含成分作用靶标共有255 个，去重后共计256个。

2.2 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化潜在靶标利用TCMIP v2.0 的“疾病相关分子库”结合GeneCards数据库共获得1 399个动脉粥样硬化疾病靶标，采用Venn分析与成分作用靶标映射取交集后共获得74个靶标（见图1）。

图1 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的靶标韦恩图Figure 1 Venn diagram of related targets of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

2.3 PPI 网络构建及核心靶标筛选将上述交集靶标导入STRING 平台，获得PPI 网络数据，采用Cytoscape 3.7.1进行可视化（见图2），所有节点的degree值中位数为3，选取degree＞3的靶标节点作为桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的核心网络靶标，共35个。

图2 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的PPI 网络Figure 2 PPI network of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

2.4 核心靶标的GO 和KEGG 通路富集分析将上述35 个核心靶标导入DAVID 在线平台进行GO 和KEGG 通路富集分析，取P＜0.001的GO 结果绘制气泡图（见图3）。结果显示，桃仁-红花的核心靶标主要参与的生物学过程包括RNA 聚合酶II 启动子转录调控、细胞分化、炎症反应、血糖稳态等过程；在分子功能上，桃仁-红花主要与RNA聚合酶II转录因子活性、锌离子结合、酶结合及类固醇结合等相关；在细胞组分方面，其主要作用于细胞核、细胞质、内质网膜等。

图3 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的核心靶标的GO 功能富集气泡图Figure 3 GO function enrichment bubble chart of key targets of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

KEGG 通路富集结果（图4）中，去掉分类属于疾病类的通路，其余取P＜0.05的KEGG通路富集结果绘制气泡图。结果显示，桃仁-红花干预动脉粥样硬化的核心靶标主要富集于PI3K-Akt 信号通路、甲状腺激素信号通路、胰岛素抵抗、AMPK 信号通路、中性粒细胞形成、脂肪细胞脂肪分解调节、Toll 样受体信号通路、TNF 信号通路、花生四烯酸代谢及细胞凋亡等信号通路。其中，富集靶标数量最多的通路分别为PI3K-Akt 信号通路和甲状腺激素信号通路。在PI3K-Akt 信号通路上共富集到7 个靶标，分别为：RXRA（类视黄醇X 受体）、IFNB1（干扰素Β 重组蛋白1）、AKT1（蛋白激酶B1）、TLR4（Toll 样受体4）、NFKB1（核因子κB1）、JAK1（酪氨酸激酶蛋白1）和INS（胰岛素受体）；在甲状腺激素信号通路上共富集到6 个靶标，分别为：NCOA2（核受体辅激活因子2）、HDAC2（蛋白脱乙酰酶2）、RXRA、AKT1、ESR1（雌激素受体1）和ACTB（肌动蛋白β）。

图4 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的核心靶标的KEGG 通路富集桑基图Figure 4 KEGG pathway enrichment Sankey diagram map of potential targets of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in intervention of atherosclerosis

2.5 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化“药材-化合物-核心靶标-作用通路”多维关联网络的构建与分析采用Cytoscape软件构建“药材-化合物-核心靶标-作用通路（H-C-T-P）”多维关联网络（见图5），综合考察桃仁-红花干预动脉粥样硬化的药效物质及作用机制。如图所示，该网络共包含80 个节点和544 个边，其中节点包括2 个药材、16 个化合物、35 个靶标和28 个作用通路靶标。利用NetworkAnalyzer插件对网络进行拓扑性质分析，以度中心性（DC）＞5，介数中心性（BC）＞0.014 5，紧密中心性（CC）＞0.343 6为筛选条件，任意满足其二的作为关键化合物、关键核心靶标及关键作用通路，结果见表1。结果表明，在H-C-T-P 网络中，儿茶素、红花素、15A，20β-二羟基-Δ4-孕烯-3-酮等13 个化合物，AKT1、PPARA、NFKB1、TLR4等9个靶标及PI3K-Akt、甲状腺激素及胰岛素抵抗等6个信号通路较为关键。

表1 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的“药材-化合物-核心靶标-作用通路”多维关联网络拓扑特征结果Table 1 Topological characteristics of multidimensional correlation network of "medicinal materials-compounds-core targets-action pathways" of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

图5 桃仁-红花药对干预动脉粥样硬化的“药材-化合物-核心靶标-作用通路”多维关联网络Figure 5 Multidimensional association network of "medicinal materials-compounds-core targets-action pathway" of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

2.6 分子对接验证关键化合物与靶标之间的相互作用选择富集在PI3K-Akt 通路上的3 个关键靶标NFKB1、AKT1 和TLR4 以及与这些靶标有相互作用的关键化合物为研究对象，例如：15Α，20ΒDihydroxy-Δ4-Pregnen-3-One 与NFKB1，Catechin、Carthamidin、Onjixanthone II 与AKT1，Arachic Acid、Palmitic Acid、Linolenic Acid 与TLR4，采用分子对接技术考察这些关键化合物与其作用靶标之间的相互作用情况。结果发现，这些化合物与其对应的靶标均能直接相互作用，结合能见表2。采用Discovery Studio 4.5结合LigPlus软件将分子对接结果可视化，见图6。

表2 关键化合物与靶标之间的结合自由能Table 2 Binding free energy between key compounds and targets

图6 关键化合物与靶标相互作用图Figure 6 Interaction diagram of key compounds and targets

2.7 动物实验验证

2.7.1桃仁-红花药对对AS 的ApoE-/-小鼠主动脉病理学变化影响 结果见图7。正常组小鼠主动脉内膜内壁平滑肌细胞形态正常、排列紧密。模型组小鼠主动脉内膜内壁出现明显动脉粥样硬化斑块突起，内膜明显增加，薄厚不一。与模型组比较，桃仁-红花中、高剂量组小鼠主动脉内膜损伤较轻，斑块减少。以上表明动脉粥样模型建立成功，桃仁-红花药对对其有一定改善作用。

2.7.2桃仁-红花药对对AS的ApoE-/-小鼠血脂的影响 从表3 可见与正常组比较，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平显著增加，HDL-C 水平降低，差异有统计学意义（均P＜0.01）。与模型组比较，桃仁-红花中、高剂量组可显著降低小鼠血清TC、TG、LDL-C（仅高剂量组）含量，增高HDL-C 含量，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

表3 各组小鼠血脂含量比较（±s，n=10）Table 3 The lipid content in each group of mice（±s，n=10）

表3 各组小鼠血脂含量比较（±s，n=10）Table 3 The lipid content in each group of mice（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

HDL-C/（nmol·mL-1）4.69±1.09 3.00±0.08**3.44±0.17 3.89±0.07##3.90±0.89##4.19±0.42##分组正常组模型组桃仁-红花低剂量组桃仁-红花中剂量组桃仁-红花高剂量组辛伐他汀组剂量/（g·kg-1）--1.30 1.94 2.58 0.002 5 TG/（nmol·mL-1）1.87±0.01 3.46±0.25**3.11±0.23#2.92±0.46##2.51±0.18##2.33±0.75##TC/（nmol·mL-1）16.63±0.42 29.50±4.00**25.62±2.28#22.70±3.49##20.81±0.89##19.67±2.62##LDL-C/（nmol·mL-1）3.03±0.28 5.10±1.02**4.78±0.13 4.28±0.98 3.60±0.67##3.40±0.64##

2.7.3桃仁-红花药对对AS 的ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6 含量的影响 结果见表4 。与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6 表达量明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，桃仁-红花药对中、高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-6 表达量明显减少（P＜0.01）。结果表明桃仁-红花药对能明显抑制高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠的主动脉炎症反应。

表4 各组小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平比较（±s，n=10）Table 4 The content of TNF-α，IL-6 in serum of mice in each group（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α/（pg·mL-1）103.99±2.17 176.77±27.66**150.02±23.25#149.77±4.87##131.20±3.61##128.69±2.39##分组正常组模型组桃仁-红花低剂量组桃仁-红花中剂量组桃仁-红花高剂量组辛伐他汀组剂量/（g·kg-1）--1.30 1.94 2.58 0.002 5 IL-6/（pg·mL-1）84.88±15.56 125.25±9.19**113.75±12.73 101.78±2.83##92.63±13.44##87.75±12.02##

2.7.4桃仁-红花药对对AS 的ApoE-/-小鼠主动脉血管关键靶标NF-κB、TLR4、AKT蛋白表达的影响 结果见图8，与正常组比较，模型组小鼠主动脉血管组织中P-NF-κB、TLR4、P-AKT蛋白表达明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，桃仁-红花中、高剂量组可明显降低其表达（P＜0.01，P＜0.05）。实验表明，桃仁-红花药对可以调节PI3K-Akt通路，抑制P-NF-κB、TLR4、P-AKT蛋白表达。

图8 各组小鼠主动脉血管NF-κB、TLR-4、AKT 蛋白表达比较（±s，n=3）Figure 8 The protein expressions of NF-κB，TLR-4，AKT in aorta of mice in each group（±s，n=3）

3 讨论

动脉粥样硬化（AS）是一种以脂质代谢异常、炎症反应和氧化应激等为主要病理基础的慢性血管性疾病[12]，抗炎、干预炎性反应网络中的一些关键靶点，对于改善AS 非常重要。现有研究[13]发现活血、祛瘀的中成药可很好地改善炎症反应、对抗AS。桃仁-红花是经典的活血化瘀药对。本研究通过网络药理学方法，揭示了桃仁-红花药对治疗AS 的潜在靶标和作用机制，结果显示，桃仁-红花49个活性成分能够作用于256个作用靶标，通过与1 399个AS疾病相关靶标进行交集映射，共获得其干预AS的74个靶标。PPI 网络共筛选35 个核心靶标，其可与桃仁-红花中16 种主要化合物如：儿茶素、谷甾醇、亚油酸、红花素等发挥抗AS 作用。KEGG 富集分析得到PI3K-Akt 信号通路和甲状腺激素信号通路为富集最多的主要通路。改善AS 的关键靶标为PPARA、IFNB1、AKT1、TLR4、NFKB1、JAK1 和INS 靶点。说明桃仁-红花治疗AS 过程中，起主导作用的可能是PI3K-Akt 通路调节及对NF-κB 等炎症蛋白的影响。

PI3K 可调节细胞的存活、增殖、迀移、分化、转录和翻译，与Akt 组成的PI3K-Akt 信号通路与AS的关系最为紧密[14-15]。研究[16]表明，通常情况下，PI3K 被激活后，可招募并激活AKT，活化的AKT 通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如NF-κB、P56、VEGF 等因子的表达。NF-κB 是细胞活动中与炎症反应密切相关的转录因子，其可介导炎症因子的转录[17]。TLR是一种新型的炎症信号传递蛋白，研究[18-19]发现，人与鼠AS 斑块大部分内皮细胞和巨噬细胞中TLR4的表达明显增加，同时伴随着NF-κB的表达参与小鼠AS的发展。

有研究[20]报道，红花的主要提取物红花素可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路对抗炎症反应改善脑皮质神经元损伤。桃仁的提取物儿茶素、花生酸等可能通过减少NF-κB 含量，改善血瘀症，减轻心肌损伤[21]。结果表明桃仁、红花可能通过调节TLR4、NF-κB 等蛋白抗炎改善心脑血管病症，这些研究结果均与本网络药理学预测相吻合。

基于网络药理学预测结果，本研究进一步对AKT1、TLR4，NFKB1关键靶标与其相互作用的化合物进行了分子对接。结合自由能结果显示，两者之间都能够直接相互作用。同时开展动物实验验证，结果发现桃仁-红花中、高剂量组能够显著降低小鼠血清中IL-6、TNF-α 含量，抑制关键靶标TLR4、NF-κB、AKT 蛋白表达，降低血脂，减小主动脉斑块面积对抗AS的发生。

综上所述，本研究基于桃仁-红花活血祛瘀的功效，探讨了其治疗AS 的现代作用机理，通过构建“桃仁，红花-化合物-核心靶标-作用通路”多维关联网络并进一步结合分子对接及动物实验验证，明确了桃仁-红花通过调节PI3K-AkT 等信号通路，抑制NF-κB、AKT、TLR4 等炎症蛋白表达，调节血脂改善AS。本研究为桃仁-红花的临床合理应用、药效物质基础及其作用机制研究提供了必要的理论支撑。