唐子溦，王艳，叶小花，谢锌仪，罗玺，时军，赵力民，赵平（.广东药科大学医药化工学院，广东 中山 58458；.广东药科大学中药学院，广东 广州 50006）

中药及中药复方在护肤领域的应用历史悠久，诸多古代中医典籍中都有关于中药美容养肤的记载，为现代中药化妆品的研发提供了重要参考。其中，记录在《太平圣惠方》《本草纲目》《唐本草》《永类钤方》中的“洗面七白散”（白芷、白牵牛、白僵蚕、白芍、白蔹、白术、白附子）的护肤功效显著，被广泛应用[1-2]。目前，“洗面七白散”中的白芷、白附子、白牵牛由于安全性方面的原因，已被《化妆品安全技术规范（2015 年版）》列入禁用化妆品名单中，但白僵蚕、白蔹、白术和白芍（“四白”）4种中药依旧在化妆品生产中广泛应用。采用现代分析技术和方法对传统中药的安全性及功效进行深入的系统研究，对中药天然化妆品新原料的开发具有重要意义。

近年来，有相关研究对“四白”中单一组分的安全性和护肤功效进行了探索，并揭示其中的白蔹[3-4]、白术[5-6]可能具有美白功效，白芍[7-8]、白僵蚕[9-10]具有抗炎、抗氧化作用，但由于中药组合作用机制错综复杂，目前对这4种中药组合的安全性及功效研究尚未见报道。因此，本文拟探讨“四白”中药复方醇提液的安全性及其抗氧化、美白、抗炎等护肤功效，以期为现代化妆品功效原料的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物KM 雌性小鼠，SPF 级，体质量（20±2）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。本研究中的动物实验经过广东药科大学动物伦理委员会审查批准，批文号：gdpu20220801。

1.2 细胞株小鼠黑色素瘤B16细胞株，由广东药科大学附属第一医院研究室提供；人永生化角质形成细胞株HaCaT，由广东药科大学生命科学与生物制药学院提供；小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7，由广东药科大学新药研发中心提供。

1.3 药物及试剂白蔹、白芍、白术、白僵蚕，购自苏州市天灵中药饮片有限公司，经广东药科大学刘基柱副教授鉴定为正品。1640 培养基（批号：8120527）、DMEM 高糖培养基（批号：2202004）、0.05%胰蛋白酶（含EDTA，批号：2376021）、青霉素/链霉素（批号：2321138），均购于美国Gibco 公司；酪氨酸酶（酶活性≥500 U·mg-1），合肥博美生物科技有限责任公司，批号：31B20972；脂多糖（LPS），上海源叶生物科技有限公司，批号：S03GS159712；透明质酸酶（酶活力≥300 U·mg-1），上海罗恩化学技术有限公司，批号：RH32634；一氧化氮（NO）检测试剂盒（货号：S0021S）、MTT（货号：ST316），均购自上海碧云天生物技术有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，货号：D807297-100mg，纯度96%）、L-酪氨酸（货号：L818844-100g，纯度99%）、L-多巴（货号：D807434-100g，纯度99%），均购自上海麦克林生化技术有限公司。

1.4 主要仪器UV-2600型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Varioskan LUX 多功能酶标仪、371 型CO2细胞培养箱，美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；OLYMPUS 倒置显微镜，日本奥林巴斯株式会社。

1.5 “四白”中药复方醇提液制备将白僵蚕、白蔹、白术、白芍4 味药材分别粉碎，过60 目筛，各取7.5 g 混合后置于锥形瓶内；用80%乙醇浸泡24 h后超声0.5 h，重复3次完成提取[11-12]；提取结束后进行抽滤，滤液浓缩后加入4倍量无水乙醇过夜，静置后离心取上清液；浓缩后加去离子水配至生药浓度为600 g·L-1，过0.22 μm微孔滤膜后于4 ℃保存。

1.6 细胞培养在HaCaT、B16、RAW264.7细胞中加入DMEM 培养基（含10%FBS、1%链霉素/青霉素），于细胞培养箱（37 ℃、5% CO2）孵育24 h；当细胞密度超过80%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，离心，以1∶3传代。

1.7 安全性实验

1.7.1红细胞溶血实验 溶血实验是体内眼刺激试验（Draize test）的一种替代方法，被广泛应用于评估药品或化妆品的眼刺激性。收集雌性KM小鼠血液，加入PBS 缓冲溶液，室温下以3 000 r·min-1离心（离心半径9 cm）15 min，弃去上清，再次加入PBS 混匀。重复离心3次后，加入血液9倍量的PBS，混匀，得到红细胞溶液。以PBS 为空白对照、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）为阳性对照、水为全溶管。取浓度为30 g·L-1的“四白”中药复方醇提液100 μL，加入875 μL PBS及25 μL红细胞溶液，室温条件下置于水平摇床振荡反应30 min，离心，取上清，于560 nm波长处测定吸光度（A）值[13-14]。计算：溶血率（HR，%）=（A受试管-A阴性对照）/（A全溶管-A阴性对照）×100%。

1.7.2MTT 法检测细胞毒性 将HaCaT、RAW264.7、B16 细胞分别接种于96 孔板，密度为每孔1×104个，于培养箱中过夜。24 h 后弃去原培养基，加入100 μL 含有“四白”中药复方醇提液的培养基（5、10、15、20、25、30 g·L-1），孵育24 h 后弃去培养基；经PBS浸洗2～3次后，每孔加入100 μL MTT工作液，于450 nm 波长处测定吸光度（A）值。计算：细胞存活率（%）=A给药孔/A空白孔×100%[15]。同法检测烟酰胺（5、10、15、20、25、30 g·L-1）对B16 细胞的毒性。

1.8 抗氧化实验

1.8.1自由基清除及Fe3+还原实验 参考相关研究方法，进行羟自由基[16]、DPPH 自由基[17-18]清除实验和Fe3+还原实验[19]。

1.8.2抗过氧化氢（H2O2）氧化损伤实验[20]用DMEM培养基将“四白”中药复方醇提液稀释至不同生药浓度。将HaCaT 细胞接种于96 孔板，细胞密度为每孔1×104个，于培养箱中培养过夜，24 h 后弃去原培养基。以DMEM 培养基为空白组，实验组加入100 μL“四白”中药复方醇提液（5、10、15、20、25、30 g·L-1），于培养箱中孵育24 h，用PBS 清洗后，加入5.6 mmol·L-1H2O2继续孵育4 h。弃去所有孔中的上清液，PBS清洗2次后，采用MTT法检测细胞存活率。

1.9 美白功效验证

1.9.1体外酪氨酸酶活性抑制实验[21-22]取“四白”中药复方醇提液（5、10、15、20、25、30 g·L-1）1 mL，并以pH=6.8 的PBS 溶液作为空白代替；加入625 μL 酪氨酸酶溶液（200 U·mL-1）后，37 ℃水浴10 min；加入1 mL 0.05% L-酪氨酸溶液，37 ℃水浴40 min，测定475 nm 波长处的吸光度值。计算：酪氨酸酶活性抑制率（%）= [1-（A-B）/（C-D）] ×100%，A～D 分别表示有样品的含酶体系、有样品的无酶体系、无样品的含酶体系、无样品的无酶体系的吸光度值。

1.9.2细胞内酪氨酸酶活性抑制实验[23-25]将B16细胞接种于96孔板中，密度为每孔1×104个，于培养箱中孵育24 h 后，弃去原培养基；以不含样品的DMEM培养基作为空白组，实验组加入由DMEM 培养基配制的“四白”中药复方醇提液（15、20、25、30 g·L-1）100 μL，孵育24 h后弃去培养基；PBS清洗2 次，加入100 μL 1% Triton X-100，置于-80 ℃急冻1 h 凝固；于室温下复融后，每孔加入20 μL 0.5% L-多巴，室温下水平振荡4 h；反应结束后于490 nm波长处测定吸光度（A）值。计算：细胞内酪氨酸酶活性抑制率（%）=A给药孔/A空白孔×100%。

1.10 抗炎实验

1.10.1透明质酸酶活性抑制实验[26-27]将125 μL“四白”中药复方醇提液（5、10、15、25 g·L-1）与125 μL 透明质酸酶-醋酸缓冲溶液均匀混合，37 ℃恒温水浴20 min；加入2.5 mmol·L-1CaCl2溶液25 μL，继续37 ℃孵育20 min；加入125 μL 透明质酸钠溶液（0.4 g·L-1）至含透明质酸酶的管内，37 ℃孵育20 min后，室温下静置10 min；加入1.0 mL超纯水、25 μL NaOH 溶液（5.0 mol·L-1）及125 μL 乙酰丙酮溶液，沸水浴15 min后冰水浴10 min，然后室温下静置10 min；加入250 μL P-DAB（EhrLich试剂），充分震荡后，加入950 μL无水乙醇，室温下静置30 min；在530 nm 波长处测定吸光度值。计算：透明质酸酶活性抑制率（%）= [1-（A-B）/（C-D）]×100%，A～D 分别表示有样品的含酶体系、有样品的无酶体系、无样品的含酶体系、无样品的无酶体系的吸光度值。

1.10.2ELISA 法检测细胞NO 水平[28-33]将RAW264.7细胞种于96孔板中，密度为每孔1×104个，在培养箱中培养过夜；24 h 后弃去原培养基，加入100 μL 由DMEM 培养基稀释的“四白”中药复方醇提液（5、10、15、20、25 g·L-1），并以无血清DMEM培养基作为空白组，加入LPS的DMEM培养基作为模型组，每组设3 个复孔；模型组及给药2 h 后的实验组直接加入10 μg·mL-1LPS，并共同孵育至24 h；反应结束后取50 μL 细胞上清液，依次加入Griess 试剂盒内的A 液、B 液各50 μL，混合均匀，室温下缓慢水平振荡反应15 min；在540 nm 波长处测定吸光度值，通过标准曲线计算NO含量。

1.11 统计学处理方法采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 “四白”中药复方醇提液对红细胞溶血率的影响结果见图1。与0.1% SDS 组比较，30 g·L-1“四白”中药复方醇提液组的红细胞溶血率（18.5%）显著降低（P＜0.01），提示“四白”中药复方醇提液的眼刺激性较0.1% SDS更低。

图1 “四白”中药复方醇提液对红细胞溶血率的影响（±s，n=6）Figure 1 Effect of alcoholic extract of "four whites" on the hemolysis rate of red blood cells（±s，n=6）

2.2 “四白”中药复方醇提液对HaCaT、B16 及RAW264.7 细胞活力的影响结果见图2。与空白组比较，“四白”中药复方醇提液及烟酰胺不同浓度组（5、10、15、20、25、30 g·L-1）的HaCaT、B16 及RAW264.7 细胞活力均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。“四白”中药复方醇提液对HaCaT、B16 及RAW264.7细胞的半数抑制浓度（IC50）值分别为（29.8±2.3）、（33.8±2.7）、（22.0±1.7）g·L-1。市面常用化妆品原料烟酰胺对B16细胞的IC50值为（26.3±1.3）g·L-1，低于“四白”中药复方醇提液对B16 细胞的IC50值［（33.8± 2.7）g·L-1］，提示“四白”中药复方醇提液可能比烟酰胺具有更低的细胞毒性。

图2 “四白”中药复方醇提液对HaCaT、B16 及RAW264.7 细胞活力的影响（±s，n=6）Figure 2 Effects of alcoholic extract of "four whites" on HaCaT，B16 and RAW264.7 cells viability（±s，n=6）

2.3 “四白”中药复方醇提液对羟自由基清除能力的影响结果见图3-A。与空白组比较，“四白”中药复方醇提液（2、4、8、16、32 g·L-1）的羟自由基清除率显著升高（P＜0.01），且呈浓度依赖性。“四白”中药复方醇提液清除羟自由基的IC50值为（17.6±0.2）g·L-1，32 g·L-1“四白”中药复方醇提液的羟基自由基清除率达到78.6%，表明其在安全浓度下具有较强的抗氧化能力。

图3 “四白”中药复方醇提液的抗氧化作用（±s，n=6）Figure 3 The antioxidant effect of the alcoholic extract of "four whites"（±s，n=6）

2.4 “四白”中药复方醇提液对DPPH 自由基清除能力的影响结果见图3-B。与空白组比较，“四白”中药复方醇提液（0.25～4 g·L-1）的DPPH 自由基清除率显著升高（P＜0.01），且呈浓度依赖性。“四白”中药复方醇提液清除DPPH 自由基的IC50值为0.6 g·L-1，较低的IC50值说明其具有优异的DPPH 自由基清除能力。

2.5 “四白”中药复方醇提液对Fe3+还原能力的影响结果见图3-C。与空白组比较，“四白”中药复方醇提液（5、10、15、20、25、30 g·L-1）对Fe3+的还原力显著增强（P＜0.01），且呈浓度依赖性，结果表明其具有良好的Fe3+还原能力。

2.6 H2O2对HaCaT 细胞活力的影响结果见图3-D。与空白组比较，H2O2不同浓度（1～9 mmol·L-1）组的HaCaT 细胞活力随着H2O2浓度增加而降低，呈浓度依赖性，其中5～9 mmol·L-1组的差异有统计学意义（P＜0.01）。H2O2对HaCaT 细胞的IC50值为（5.6±0.2）mmol·L-1，因此后续选择该浓度建立HaCaT细胞氧化损伤模型。

2.7 “四白”中药复方醇提液对H2O2致氧化损伤HaCaT细胞活力的影响结果见图3-E。与空白组比较，模型组HaCaT 细胞活力显著降低（P＜0.01），说明H2O2诱导HaCaT 细胞氧化损伤模型复制成功。与模型组比较，“四白”中药复方醇提液（5、10、15、20、25、30 g·L-1）预保护后，HaCaT 细胞活力有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。20 g·L-1“四白”中药复方醇提液预保护能使HaCaT细胞活力从39.6%上升到57.3%，细胞氧化损伤得到一定恢复。

2.8 “四白”中药复方醇提液对体外酪氨酸酶活性的影响结果见图4-A。随着“四白”中药复方醇提液浓度的升高，酪氨酸酶活性抑制率逐渐升高，呈现良好的剂量依赖性。在30 g·L-1浓度时，活性抑制率达到92.1%，表明酪氨酸酶活性受到了明显的抑制。

图4 “四白”中药复方醇提液的美白功效验证（±s，n=5）Figure 4 Validation of the whitening efficacy of alcoholic extract of "four whites"（±s，n=5）

2.9 “四白”中药复方醇提液对B16 细胞酪氨酸酶活性的影响结果见图4-B。与空白组比较，“四白”中药复方醇提液（15、20、25、30 g·L-1）对B16细胞的酪氨酸酶活性抑制率显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且呈现良好的剂量依赖性。在30 g·L-1浓度时，抑制率可达49.4%，表明“四白”中药复方醇提液对B16细胞酪氨酸酶活性具有明显抑制作用。

2.10 “四白”中药复方醇提液对透明质酸酶活性的影响结果见图5-A。随着“四白”中药复方醇提液浓度的升高，透明质酸酶活性抑制率逐渐升高，呈现一定的剂量依赖性，表明“四白”中药复方醇提液具有良好的透明质酸酶活性抑制效果。

图5 “四白”中药复方醇提液的抗炎活性验证（±s，n=5）Figure 5 Validation of anti-inflammatory activity of alcoholic extract of "four whites"（±s，n=5）

2.11 “四白”中药复方醇提液对LPS 诱导RAW264.7细胞NO 水平的影响结果见图5-B。与空白组比较，LPS 模型组细胞的NO 含量显著增加（P＜0.01），表明LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型复制成功。与模型组比较，“四白”中药复方醇提液（5、10、15、20、25 g·L-1）不同浓度组RAW264.7 细胞的NO 含量显著降低（P＜0.01）。结果表明，“四白”中药复方醇提液能够降低LPS 诱导RAW264.7 炎症细胞的NO水平。

3 讨论

本研究对“四白”中药复方醇提液的安全性、抗氧化、美白及抗炎活性进行了初步研究。研究结果显示，中药复方醇提液组的红细胞溶血率显著降低，提示其眼刺激性较0.1% SDS 更低；对HaCaT、B16、RAW264.7 细胞的IC50值在22～33 g·L-1范围内，其中对B16细胞的IC50值比市面常用化妆品原料烟酰胺更低，具有较好的安全性。

中药的抗氧化性能与其美白、抗衰功效密切相关。羟自由基是生物体内最活跃的自由基之一，具有很强的氧化能力，可以与生物分子中的多种化合物发生反应，导致细胞膜、DNA、蛋白质等生物分子的氧化损伤，从而引起氧化应激反应和衰老[16]。Fe3+还原能力与样品的抗氧化能力呈正相关[19]。研究结果显示，“四白”中药复方醇提液能有效清除羟基自由基及DPPH 自由基，且具有良好的Fe3+还原能力，并对H2O2诱导HaCaT 细胞的氧化损伤具有预保护能力。

人体皮肤黑色素的分布和含量决定了肤色，而酪氨酸酶是黑色素形成过程中的限速酶，酪氨酸酶活性越高，皮肤黑色素形成就越多，抑制酪氨酸酶活性对美白具有重要意义[21]，同时也是筛选美白药物活性成分的重要靶点。研究结果显示，“四白”中药复方醇提液在无细胞毒性的浓度范围内，在体外和细胞内都表现出明显的酪氨酸酶抑制活性，可能作为化妆品美白原料。

透明质酸酶是炎症发生发展过程中的重要酶类物质，其可以高效、专一水解透明质酸，引起人体细胞脱颗粒及介质渗出，直接导致过敏及炎症反应的发生[26-27]。透明质酸酶是抗炎功效研究的重要靶点，降低或抑制透明质酸酶活性是防止炎症发生的有效途径。NO 是炎症反应的一个重要负反馈调节分子，可促进炎症引起的细胞及组织功能障碍。而LPS可以通过细胞信号转导系统激活多种细胞合成或释放NO、IL-6、TNF-α 等多种炎性介质。研究结果显示，在体外透明质酸酶活性抑制实验中“四白”中药复方醇提液具有良好的透明质酸酶抑制效果；LPS诱导RAW264.7 细胞NO 水平显著升高，而“四白”中药复方醇提液预处理能够明显降低RAW264.7炎症细胞的NO水平，具有一定的抗炎潜力。

综上所述，“四白”中药复方醇提液具有较低的刺激性和细胞毒性，且有一定的抗氧化、美白及抗炎功效，在中药化妆品领域具有一定应用潜力，值得进一步研究开发。