张明昊，张家乐，吴星霏，申艳朵，吴刘俊，张家明，王瑾瑾（河南中医药大学医学院，河南 郑州 450046）

肝豆状核变性（Hepatolenticular degeneration，HLD）又称Wilson病（Wilson’s disease，WD），是一种常染色体隐性遗传病，该病因位于13q14.3的腺嘌呤核苷三磷酸7b（ATP7b）基因突变，致使铜蓝蛋白（Ceruloplasmin，CP）合成及铜在胆汁中的排泄出现障碍，大量的铜沉积于肝脏、脑、肾脏、角膜等组织中，可使患者出现肝硬化、椎体外系症状及角膜色素环（K-F 环）等多种临床表现，严重者可危及生命[1-2]。西医对HLD 的治疗主要以青霉胺、二巯丙磺酸钠、二巯基丙醇、二巯基丁二酸为代表的金属络合剂来促进机体排铜，其中青霉胺一直是治疗HLD的首选药物。上述药物虽能使机体大量排铜，但长期使用会出现诸多不良反应，如可引起溶血性贫血、皮肤紫癜、狼疮样综合征等，且易使患者产生耐受性[3-4]。

依据临床症状可将HLD 归为中医学的“震颤”“积聚”“黄疸”“癫狂”等范畴，与风、痰、虚、瘀有关，责之于肝，故多以平肝熄风、疏肝利胆、清热退黄为治疗原则[5-6]。黄芩苷（Baicalin，分子式：C21H18O11）是中药黄芩的主要有效成分之一，属葡萄糖醛酸苷类化合物，具有清热解毒、疏肝利胆、抗菌抗炎、络合金属离子、抗氧化及抗血栓等药理作用，临床上可用于病毒性肝炎、肾炎、感染等疾病的治疗[7-8]，但少有治疗HLD 的报道。本课题组前期研究[9-10]发现，黄芩为中医治疗HLD方剂中的常见中药，其主要成分黄芩苷又是一种很好的金属络合剂，且黄芩苷清热解毒、疏肝利胆的作用符合中医治疗HLD 的思路。因此，本课题组拟用黄芩苷对HLD 大鼠进行干预，以青霉胺为阳性对照药物，观察黄芩苷对HLD 大鼠铜代谢、肝功能及肝脏病理变化的影响，并基于铜代谢途径探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物8 周龄雄性SD 大鼠，体质量180～200 g，购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，实验动物生产许可证号：SCXK（豫）2019-0002，动物质量合格证号：110981201100002567。本实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会审批，动物伦理批文号：DWLL202201010。

1.2 药物及试剂黄芩苷胶囊（每粒250 mg），批号：2006004，东莞市金美济药业有限公司；青霉胺（每片125 mg），批号：137200602，上海上药信谊药厂有限公司；青霉胺、黄芩苷均溶于0.1% CMC-Na 制成混悬液。五水合硫酸铜（CuSO4· 5H2O），批号：20191101，烟台市双双化工有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na），批号：20160704，上海国药集团化学试剂有限公司；铜（Cu，货号：E010-1-1）、谷丙转氨酶（GPT，货号：C009-1-1）、谷草转氨酶（GOT，货号：C010-1-1）测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；兔SP 试剂盒（货号：SP-9001）、DAB 显色试剂盒（货号：ZLI-9018），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗大鼠铜转运体1（CTR1，货号：bs-10773R）、金属巯蛋白（MT，货号：bs-10568R）、腺嘌呤核苷三磷酸7B（ATP7B，货号：bs-1718R）、细胞色素氧化酶17（COX17，货号：bs-14005R）抗体，均购自北京博奥森生物技术有限公司； 抗氧化蛋白1（ATOX1，货号：EPR10352）、超氧化剂物歧化酶铜伴侣蛋白（CCS，货号：EPR9712）抗体，均购自英国Abcam 公司；TriQuick 总RNA 提取试剂（货号：R1100）、cDNA 合成试剂盒（货号：G3330）、实时荧光定量PCR扩增试剂（货号：G3320），均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 仪器BS110S 型电子天平，北京塞多利斯天平公司；MR-96TB 型酶标仪，骋克仪器（上海）有限公司；RM2235 型石蜡切片机，德国Leica 公司；D3024R 型台式高速冷冻型微量离心机，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；YD-6D 型组织包埋机、YD-A 型组织摊片机、YD-B 型组织烤片机，金华市科迪仪器设备有限公司；CX23 型光学显微镜，日本奥林巴斯公司；Stepone plus 型荧光定量PCR 仪，美国ABI公司。

1.4 分组、模型复制及给药取雄性SD 大鼠50 只，适应性饲养1 周后，以CuSO4·5H2O 为铜源，按300 mg·kg-1灌胃CuSO4·5H2O 溶液，每日1 次，连续30 d，复制铜负荷HLD 大鼠模型。然后随机分为模型组、青霉胺组和黄芩苷低、中、高剂量组，每组10 只，另取10 只大鼠作为正常组。黄芩苷、青霉胺的成人给药剂量分别为1.5、1.0 g·d-1，根据人鼠剂量换算公式（S200g大鼠=0.018×S70kg人）计算，得到黄芩苷、青霉胺的大鼠给药剂量分别为135、90 mg·kg-1。以折算剂量135 mg·kg-1为黄芩苷中剂量；以67.5 mg·kg-1（折算剂量的1/2倍）为黄芩苷低剂量；以270 mg·kg-1（折算剂量的2倍）为黄芩苷高剂量；以90 mg·kg-1为青霉胺剂量。各组大鼠造模同时灌胃给药，灌胃体积10 mL·kg-1，每日1 次，连续30 d；正常组和模型组大鼠灌胃等体积0.1% CMC-Na溶液。

1.5 样本采集末次给药后将各组大鼠单只置于代谢笼中留取24 h 尿液；然后腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，腹主动脉取血；所得尿液、血液以3 000 r·min-1（离心半径10 cm）离心10 min，取上清液于-80 ℃下储存。然后处死大鼠，解剖取肝脏；去除周围结缔组织，生理盐水洗涤；用滤纸吸尽肝脏表面液体，拍照，称质量；计算：肝脏系数=肝脏质量（g）/体质量（g）。再将肝组织一分为二，其中1份用4%多聚甲醛溶液固定；另1份用液氮速冻后于-80 ℃下储存。

1.6 尿铜、血铜、肝铜水平检测严格按照试剂盒说明书步骤操作，检测各组大鼠血清及尿液中的铜水平。取冻存肝组织0.1 g，加入0.9 mL 冰生理盐水制备10%组织匀浆液，以3 000 r·min-1（离心半径10 cm）离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书步骤检测肝组织中的铜水平。

1.7 肝功能检测严格按照试剂盒说明书步骤操作，检测各组大鼠血清及肝组织中的GPT、GOT水平。

1.8 肝组织病理学观察将各组大鼠肝脏组织用4%多聚甲醛溶液固定后，经脱水、透明、包埋后切片（4 μm）；切片经二甲苯脱蜡、苏木素-伊红（HE）染色，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，在光学显微镜下观察肝脏组织病理变化。

1.9 免疫组织化学法检测肝组织中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 蛋白表达水平将肝脏组织石蜡切片经脱蜡、水化后，用H2O2封闭；PBS清洗后，柠檬酸盐缓冲液热修复；滴加山羊血清封闭液，室温下孵育，倾去液体；分别滴加CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 抗体（1∶200），4 ℃下孵育过夜；滴加二抗后37 ℃下孵育20 min，DAB 显色，自来水冲洗；苏木素复染1～2 min，盐酸乙醇分化后，自来水再次冲洗；然后脱水、透明、封片、镜检。每只大鼠肝脏切片在光学显微镜（×400）下随机选取1 个视野，以棕黄色为阳性染色，采用Image-Pro Plus 6.0 软件测定每个视野中的积分光密度（IOD）值，以此评价目标蛋白的表达水平。

1.10 Real-time PCR 法检测肝组织中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT mRNA 表达水平取100 mg 大鼠肝组织，用液氮研磨后收集于EP 管中，加入1 mL TriQuick 试剂提取肝组织总RNA，检测RNA 含量和纯度（A260/A280=1.8～2.0）。采用Servicebio 逆转录试剂盒进行逆转录反应，反应条件为：65 ℃、5 min，42 ℃、60 min，70 ℃、5 min，4 ℃保持。然后进行PCR 反应，反应体系为15 μL；反应条件：预变性95 ℃、10 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、1 min，共40 个循环。扩增反应后进行熔解曲线分析，判断产物是否有非特异性扩增；分析扩增曲线，计算Ct 值；以GAPDH 为内参基因，采用2-△△CT法计算各组间mRNA 表达水平差异，正常组基因表达量设为1；实验重复3 次。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.11 统计学处理方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩苷对HLD 大鼠尿铜、肝铜及血铜水平的影响结果见图1。与正常组比较，模型组大鼠的尿铜、肝铜、血铜水平明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，青霉胺组和黄芩苷低、中、高剂量组大鼠的尿铜、肝铜、血铜水平明显降低（P＜0.05）。结果表明，黄芩苷能改善HLD大鼠的尿铜、肝铜及血铜水平。

图1 黄芩苷对肝豆状核变性大鼠尿铜、肝铜及血铜水平的影响（±s，n=10）Figure 1 Effects of baicalin on the levels of urine copper，liver copper and serum copper in hepatolenticular degeneration rats（±s，n=10）

2.2 黄芩苷对HLD 大鼠肝脏功能的影响结果见图2。与正常组比较，模型组大鼠的肝脏系数以及血清和肝脏GPT、GOT水平均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，青霉胺和黄芩苷低、中、高剂量组大鼠的肝脏系数以及血清和肝脏GPT、GOT 水平均明显降低（P＜0.05）。结果表明，黄芩苷能改善HLD 大鼠的肝功能。

图2 黄芩苷对肝豆状核变性大鼠肝功能的影响（±s，n=10）Figure 2 Effect of baicalin on liver function in hepatolenticular degeneration rats（±s，n=10）

2.3 黄芩苷对HLD 大鼠肝组织病理变化的影响结果见图3。正常组大鼠肝细胞核清晰，呈圆形、居中，肝小叶结构完整。与正常组比较，模型组大鼠的肝细胞肿大，胞质疏松呈丝网状，出现羽毛状变性及网状坏死等病理变化，与HLD 引起的肝脏损伤特征一致，表明造模成功。与模型组比较，青霉胺组和黄芩苷低、中、高剂量组大鼠的肝细胞羽毛状变性与网状坏死程度明显减轻。结果表明，黄芩苷能改善HLD引起的肝脏组织病理损伤。

图3 黄芩苷对肝豆状核变性大鼠肝组织病理变化的影响（HE 染色，×400）Figure 3 Effect of baicalin on liver histopathology in hepatolenticular degeneration rats（HE staining，×400）

2.4 黄芩苷对HLD 大鼠肝组织中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 蛋白表达水平的影响结果见图4。与正常组比较，模型组大鼠肝组织中CTR1、MT 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、CCS、COX17蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，青霉胺组和黄芩苷低、中、高剂量组大鼠肝组织中CTR1、MT蛋白水平明显降低（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、CCS、COX17蛋白水平明显升高（P＜0.05）。

图4 黄芩苷对肝豆状核变性大鼠肝组织中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 蛋白表达水平的影响（免疫组化，×400；±s，n=10）Figure 4 Effects of baicalin on protein expression levels of CTR1，ATOX1，ATP7B，CCS，COX17 and MT of liver tissues in hepatolenticular degeneration rats（IHC，×400；±s，n=10）

2.5 黄芩苷对HLD 大鼠肝组织中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT mRNA表达水平的影响结果见图5。与正常组比较，模型组大鼠肝组织中CTR1、MT mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、CCS、COX17 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，青霉胺组和黄芩苷低、中、高剂量组大鼠肝组织中CTR1、MT mRNA水平明显降低（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、COX17 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05），青霉胺组和黄芩苷中、高剂量组大鼠肝组织中CCS mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）。

图5 黄芩苷对肝豆状核变性大鼠肝组织中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT mRNA 表达水平的影响（±s，n=3）Figure 5 Effects of baicalin on mRNA expression levels of CTR1，ATOX1，ATP7B，CCS，COX17 and MT of liver tissues in hepatolenticular degeneration rats（±s，n=3）

3 讨论

肝豆状核变性（HLD）患者因染色体异常导致与铜离子结合形成铜蓝蛋白的α2球蛋白合成水平下降，铜从胆汁排出减少，大量蓄积于肝、肾及脑基底节膜，故尿铜、肝铜和血铜水平可作为该病的客观评价指标[11]。目前HLD 研究中尚无动物模型可以完全复制其临床特征，但高铜饮食可在大鼠肝脏中产生类似于HLD 特征的铜蓄积[12]。本实验通过灌胃CuSO4·5H2O 造成大鼠体内铜蓄积，引发肝脏损伤，进而构建了HLD 大鼠模型，结果发现HLD 大鼠尿铜、肝铜、血铜水平明显升高，表明造模成功。

西医治疗HLD 主要围绕机体铜代谢异常展开，以促进机体排铜、抑制机体对铜的吸收和相应器官组织损伤的对症治疗为主要思路，通过金属络合剂、锌剂等药物及肝移植来实现。金属络合剂可与机体血液及组织中的铜离子络合形成水溶性络合物，再通过胆道、尿液排出体外，此类药物虽排铜量高，但会使机体产生诸多不良反应[3-4]。锌剂可诱导人体肠上皮细胞中金属硫蛋白的合成，使铜优先与该蛋白结合，抑制肠道对铜的摄取，但锌从高铜组织中将铜排出体外的能力有限[13]。中医治疗HLD以平肝熄风、疏肝利胆及清热退黄为原则，以肝豆汤、肝豆片和柴黄肝豆散为代表方剂，在个案报道中疗效较好，且毒副作用小[14-15]。本课题组在前期研究[7]中分析中医治疗HLD的方剂发现，黄芩是这些方剂中普遍使用的中药，其清热燥湿、泻火解毒功效有助于对HLD 的治疗。黄芩苷是中药黄芩的有效成分[8]，其清热解毒、疏肝利胆及络合金属离子的作用符合中西医对HLD 的治疗思路。故本实验选择了黄芩苷干预HLD 大鼠，结果发现黄芩苷能明显降低HLD 大鼠的尿铜、肝铜、血铜水平，表明其可以降低HLD大鼠体内的铜蓄积水平。

铜在体内蓄积具有选择性，以肝脏沉积居多，故HLD 的发生通常会伴随肝功能异常和肝组织损伤。肝脏系数可以反映肝脏的状态，其升高则提示肝脏可能出现了肿胀、肥大等病理变化；GPT、GOT水平可反映肝细胞膜的稳定性，是临床上判断肝功能异常的常用指标，其水平升高则提示肝细胞发生病变[16-17]。本实验结果发现，HLD 大鼠的血清GPT、GOT 水平及肝脏系数明显升高，肝组织出现羽毛状变性及网状坏死，而黄芩苷可以下调其GPT、GOT水平，降低肝脏系数，改善肝组织变性，表明黄芩苷对HLD大鼠肝脏具有较好的保护作用。

排铜是逆转HLD 临床症状的一个主要途径。在肝细胞内，铜离子会被转运、加工和利用，这一过程由铜代谢与转运途径的多个蛋白参与，一旦发生异常，铜将蓄积于肝脏，过载后将溢出入血，随尿排出。CTR1 蛋白由190 个氨基酸残基组成，可将细胞外铜离子特异地转运到细胞内，其表达水平受细胞内铜离子浓度影响。铜离子进入细胞后，可与2个ATOX1 单体结合形成同源二聚体，利用ATP 水解产生的能量，以剂量依赖和可饱和的方式将铜离子转运到ATP7B 的氨基末端，并在细胞水平上调节铜离子的分布情况。ATP7B 一方面接收ATOX1 传递而来的铜离子合成铜蓝蛋白（CP），另一方面诱导高铜环境下的铜离子从胆道排出。有研究[18]显示，多数HLD患者的ATP7B 基因发生突变致使其功能缺陷，肝细胞内CP合成和胆汁铜排泄障碍，引起血清CP水平降低和铜在肝脏、肾脏等脏器中蓄积。CCS 蛋白由270～300个氨基酸残基组成，可将铜离子传递给超氧化物歧化酶1（SOD1），促进SOD1 的歧化作用，保护细胞免遭氧化自由基损害，并维持细胞内的铜稳态。MT不直接参与铜摄取与转运，而是起铜储存和隔离游离铜毒性的作用。高铜环境下，MT可以暂时与铜离子结合，使胞质内的铜浓度短时间内维持在合适水平[19]。线粒体细胞色素C氧化酶（COX）是呼吸链末端限速酶，也是一种铜依赖酶，它的两个亚基单位COX1 和COX2 分别有一个铜结合区，可把铜传递给COX17，由此催化细胞色素C（Cyt）的电子转移给分子氧，矢量质子通过基质泵转运到膜间隙，形成跨膜质子梯度，线粒体ATP 合酶即可利用该梯度驱动ATP 合成，故COX17 对维持线粒体铜稳态有重要意义[18，20-21]。本实验结果发现，HLD 大鼠肝组织中ATP7B、ATOX1、CCS、COX17蛋白及mRNA 表达水平明显降低，而黄芩苷可以上调ATP7B、ATOX1、CCS、COX17蛋白及mRNA表达水平，以促进铜离子排出，降低肝组织中的铜水平，减轻高铜负荷所致的肝脏损伤；此外，HLD 大鼠肝组织中CTR1、MT蛋白及mRNA 表达水平明显升高，而黄芩苷可以下调CTR1、MT蛋白及mRNA表达水平，以减少肝细胞对铜离子的摄入，降低肝细胞内的铜离子水平。

综上所述，黄芩苷能降低HLD 大鼠体内的铜蓄积水平，并改善肝功能及肝脏组织病理损伤，其机制可能与调节铜代谢途径相关因子表达水平有关，该研究结果可为黄芩苷在HLD 治疗方面的深入研究提供参考。