刘东彦 石晓峰* 王 信 王新娣 马趣环 张家旭

（1.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

全世界松科植物共有10个属230余种，我国松树有10个属120余种，可供药用的达13种。我国南方有丰富的马尾松（Pinus massonianaLamb.）、油松（P.abulacformisCarr.）、刺松（Juniperus formosanaHayata）、云南松（P.yunnaenisFrench.）、湿地松（P.elliottii）、华山松（P.armandiFranch.）等，北方有红松（P.karaiensSieb et Zucc.）、白皮松（Pinus bungeanaZucc.ex Endl）.、黑松（P.thunbergiiPurl.）、雪松（Cedrus deodara(Roxb) G.Don）、落叶松（Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen.）、樟子松（P.sylvestrisvar.mongolica Litv.）等[1]。松树的利用价值很高[2-5]。课题组前期通过对7种松柏科植物的嫩枝、松针及雪松不同采集期、不同部位中莽草酸的含量测定，发现4月和5月份采集雪松松针中莽草酸的含量较高，嫩枝次之，其他部位含量较低[6-7]，并针对其松针中莽草酸的开发进行了大量研究[8-11]，建立了水提—醇沉—柱层析—重结晶提取法，可获得纯度达95%以上的莽草酸。而莽草酸是抗病毒药物的中间体，主要应用于磷酸奥司他韦的合成[12]。鉴于此，本研究收集甘肃产（兰州和天水）雪松、白皮松、油松、华山松、樟子松及落叶松6种松树4～5月份的松针和嫩枝，测定其中的莽草酸含量，筛选出莽草酸含量高的松树部位，用于后续制备莽草酸的原料，为莽草酸的资源开发及松树的有效利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

莽草酸（批号MUST-14110807，纯度97.19%），购自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇为色谱纯；磷酸等其余试剂均为分析纯。

考察甘肃产松树品种[13-14]，主要有雪松、油松、华山松、白皮松、樟子松和落叶松六大品种。参考课题组对雪松的研究，笔者选择兰州和天水两大城市，采集同一地点、同一时间6种松树。兰州雪松、白皮松、油松、华山松、樟子松及落叶松6种松树于2021年4月19日采自甘肃省兰州市植物园；天水雪松、白皮松、油松、华山松、樟子松及落叶松6种松树于2021年5月8号采自甘肃省天水市小陇山林业研究院。经甘肃省医学科学研究院鉴定其品种，阴干后分别收集松针和嫩枝，粉碎后过药典二号筛。样品信息如表1所示。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.2 试验仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1260），美国安捷伦公司；超声波提取仪（SK3310LHC），上海科导超声仪器有限公司；万分之一分析天平（AE260），瑞士Mettle公司；高速多功能粉碎机（CX-100），上海市晟喜制药机械有限公司；艾科浦超纯水机（AWL-0501-M），重庆颐样企业发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇/0.1%磷酸水溶液（10∶90，体积比），检测波长为217 nm，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min，进样量为20 μL，理论板数按莽草酸峰计算应不低于6 000。

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥36 h的莽草酸对照品10.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，加纯净水溶解并定容，配制成浓度为0.2 mg/mL的莽草酸对照品储备液。精密吸取莽草酸对照品储备液3 mL，置于10 mL的容量瓶中，加纯净水定容，配制成浓度为60 μg/mL的莽草酸对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备

精密称取S1号（天水雪松松针）样品约0.2 g，置于25 mL的具塞锥形瓶中，精密加入纯净水20 mL，称取重量，浸泡10 min，超声处理40 min（温度为50 ℃，功率为40 W）。待冷却后再次称取重量，并用纯净水补足减失的重量，摇匀过滤后，吸取续滤液1 mL，置于25 mL的容量瓶中，加纯净水定容并摇匀，使用0.45 μm的滤膜进行过滤，得到样品。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性关系的考察

精密吸取浓度为60 μg/mL的莽草酸对照品溶液，分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL的容量瓶中，加纯净水定容摇匀，配制成系列浓度的莽草酸对照品溶液，使用HPLC进行检测。以莽草酸浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程：Y=60.190 6X+13.993 8(r=0.999 5)，且莽草酸浓度在3.0～60 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.4.2 精密度试验

精密吸取浓度为24 μg/mL的莽草酸对照品溶液20 μL，使用HPLC进行检测，重复进样6次，测得其峰面积的RSD为0.91%（n=6），表明仪器的精密度良好。

1.4.3 重复性试验

精密称取S1号样品约0.2 g，共6份，制备供试品溶液，使用HPLC进行检测。测得其中莽草酸的平均含量为30.45 mg/g，RSD为1.33%（n=6），表明该方法重复性较好。

1.4.4 稳定性试验

在1.4.3的基础上，分别将供试品溶液静置0、2、4、6、8、10、24 h后再进行HPLC检测。测得莽草酸峰面积的RSD为1.41%，表明样品在24 h内稳定性良好。

1.5 验证试验

将不同品种、产地和部位松树中莽草酸的含量导入SPSS 19.0软件（若某一样品中莽草酸的含量检测不到，则将其含量输为0.001），对24批样品中莽草酸的含量进行Z得分标准化处理，随后以平方Euclidean距离为度量标准，采用组间联接法，对标准化处理后的数据进行系统聚类分析[15-17]。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

莽草酸是一个可发生电离的弱酸，在溶液中pH值小于2.67时才以分子形式存在[18]。在色谱柱选择上，前期试验曾用过Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)[7]、Agilent TC-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)[8]和Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)[10]，短柱出峰时间2.3 min，样品色谱图和对照品色谱图非常相似，因此沈薇[19]采用LC-MS/MS鉴别了目标峰莽草酸的纯度。本试验优化了流动相甲醇-0.1%磷酸溶液的比例(5∶95、7∶93、10∶90)，选甲醇-0.1%磷酸溶液(10∶90)，六种松树收集的松针和松枝中莽草酸均达到分离，目标峰莽草酸出峰时间3.1 min，达到试验要求，色谱图如图1所示。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 加样回收率分析

精密称取上述莽草酸含量为30.45 mg/g的S1号样品约0.1g，共6份，加入莽草酸对照品适量，制备供试品溶液，使用HPLC进行检测，发现莽草酸的平均回收率为100.4%（n=6），RSD为1.71%，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

2.3 样品含量分析

精密称取6种松树24批样品各0.2 g，每个样品3份，制备供试品溶液，使用HPLC进行检测，计算每个样品中莽草酸的含量，结果如表3所示。

表3 样品含量测定结果 ( ±s ,n = 3)Tab.3 Results of content determination of sample( ±s,n= 3)

表3 样品含量测定结果 ( ±s ,n = 3)Tab.3 Results of content determination of sample( ±s,n= 3)

注：“-”代表未检出。

编号莽草酸含量/(mg·g-1)S131.47±0.41 S224.27±0.25 S316.94±0.16 S429.88±0.28 S53.83±0.45 S6-S729.66±0.22 S821.13±0.31 S911.13±0.40 S1018.46±0.36 S11-S12-S136.98±0.31 S142.08±0.43 S151.62±0.24 S164.66±0.34 S170.95±0.38 S181.70±0.26 S192.99±0.36 S201.91±0.41 S211.79±0.43 S223.74±0.29 S230.28±0.46 S240.66±0.48

2.4 直观分析

为便于比较，将6种松树24批样品中莽草酸的含量按天水松针、兰州松针、天水嫩枝和兰州嫩枝分别绘图，进行重叠显示，如图2所示[20-21]。由图2可知，6种松树不管是天水产还是兰州产，也不论品种、部位，其莽草酸含量基本一致。莽草酸含量由高到低依次为雪松、华山松、白皮松、油松、樟子松和落叶松。因此，天水雪松松针、兰州雪松松针、天水白皮松及天水华山松松针，可作为开发莽草酸的优选资源。

图2 直观分析图Fig.2 The visual analysis

2.5 聚类分析

聚类分析结果如图3所示[22-23]。聚类分析表明，在度量距离为5时，24批样品可聚为3类，其中天水雪松松针（S1）、天水白皮松松针（S2）、天水华山松松针（S4）和兰州雪松松针（S7）聚合为一类，天水油松松针（S3）、兰州白皮松松针（S8）和兰州华山松松针（S10）聚合为一类，其余样品聚为一类。不同样品按松树品种、产地和部位聚合，与2.4章节的直观分析结果一致。

图3 24 批样品聚类树状图Fig.3 Dendrogram of twenty-four batches of samples

3 结论

6种松树松针中的莽草酸含量差距较大，落叶松和樟子松松针中基本不含莽草酸，雪松松针中的莽草酸含量最高，其次为华山松松针和白皮松松针，而松枝中莽草酸的含量均较低。不同产地采集松树中莽草酸的含量也存在差异，除了采集时间的影响外，生长环境也会影响其莽草酸的含量。

通过本试验研究筛选得到天水雪松松针、兰州雪松松针、天水白皮松及天水华山松松针中莽草酸的含量较高，参考课题组前期建立的水提—醇沉—柱层析—重结晶制备雪松松针中莽草酸的方法[24]和《雪松叶》甘肃省中药材标准[25]，以其作为制备莽草酸的原料，批量制备莽草酸，将制备的莽草酸申请纳入中国食品药品检定研究院标准物质，供研究者广泛使用；并为合成磷酸奥司他韦提供丰富的原料，实现松树资源的有效利用。