王莹，张明晖

赤峰市医院肿瘤内三科，内蒙古赤峰024000

肺癌是严重威胁我国居民健康的主要公共卫生问题之一。据统计，2020年我国肺癌新发病例约82万例、死亡病例约72万例，其发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤首位。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的组织学类型，占所有肺癌的80%～85%，根据病理学类型可分为腺癌、鳞癌、大细胞癌三个亚型［1］。NSCLC早期症状不典型，大多数患者发现时已是中晚期，5年生存率较低［2］。但目前NSCLC的发病机制仍不完全清楚。可变剪切是指一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同mRNA剪接异构体的过程，主要包括可变启动子（AP）、可变终止子（AT）、外显子跳跃（ES）、可变供体位点（AD）、可变受体位点（AA）、内含子保留（RI）和外显子互斥（ME）七种可变剪切事件［3］。可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，也是真核生物转录组复杂性和多样性的重要原因。以往研究报道，可变剪切基因异常几乎与肿瘤细胞的所有特征表型有关，能够参与包括NSCLC在内的多种肿瘤的发生、发展以及治疗耐药［4］。本文结合文献就可变剪切基因在NSCLC中作用的研究进展作一综述。

1.变剪切基因概述

可变剪切是指一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同mRNA剪接异构体的过程。mRNA从前体到成熟需要去除内含子及连接外显子，其中顺式作用元件与反式作用因子相互作用，影响剪切位点，使得某些mRNA改变了原始阅读框架，导致一个基因产生多种不同的异构体，从而编码不同结构或功能的蛋白质［5］。前体mRNA的可变剪切过程是多细胞生物中基因表达调控的普遍模式之一，涉及多序列基序与同源蛋白质的相互作用，其错误调节能够影响细胞的增殖、凋亡以及血管生成和能量代谢等。可变剪切基因活性改变是恶性肿瘤中可变剪切失调的重要原因之一，特定基因的剪切变体可直接介导恶性肿瘤的发生、发展，如BRCA1、p53等［6］。

可变剪切能够使一个基因产生多个mRNA，最终产生不同的蛋白质。肿瘤细胞在可变剪切过程中具有肿瘤类型特异性及亚型特异性。有学者对包括肺癌在内的32种不同肿瘤可变剪切基因分析发现，绝大多数可变剪切基因只存在于肿瘤组织中［7］。一项生存分析发现，可变剪切事件与肺腺癌或肺鳞癌患者的总生存期显著相关［8］。LIU等［9］研究报道，肺腺癌预后相关的可变剪切事件与免疫细胞浸润程度、肿瘤突变负荷、免疫检查点表达水平以及免疫应答高度一致。以上研究表明，可变剪切在NSCLC的发生、发展中起着至关重要的作用。

2.SCLC中的可变剪切基因及其作用

目前，全基因组研究已公布了27种人类恶性肿瘤中超过15 000个可变剪切基因。在肺癌中的可变剪切基因主要包括B淋巴细胞瘤xL（Bcl-xL）、甘氨酸脱羧酶（GLDC）、RNA结合蛋白（RBM）、富丝氨酸/精氨酸的剪接因子（SRSF）、内收蛋白3（ADD3）及酪氨酸激酶受体（MET）等，这些可变剪切基因能够参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物学行为［10］。本文重点介绍其中六种具有潜在临床价值的可变剪切基因及其变体。

2.1.ET MET是一种原癌基因，定位于人染色体7q21-31，长度约125 kb，含有21个外显子。MET的主要突变类型包括14外显子跳跃突变、基因扩增、激酶域突变以及基因融合等［11］。其中，MET 14外显子跳跃突变是近年来备受关注的突变类型。研究报道，MET 14外显子跳跃突变可使含有E3泛素连接酶c-Cbl的近膜端结构域缺失，MET蛋白泛素化降低，致使MET蛋白不断积累，从而使MET信号通路持续激活，继而导致肿瘤发生。MET的编码蛋白具有酪氨酸激酶活性，是一种肝细胞生长因子（HGF）酪氨酸激酶受体，被配体激活后可导致其下游信号通路的激活，如Ras/ERK/MAPK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和STAT等信号通路，进而导致肿瘤细胞增殖、侵袭以及肿瘤血管生成［12］。在NSCLC患者中，MET 14外显子跳跃突变的发生概率为1%～3%，多见于老年NSCLC患者，一般不与EGFR、ALK、ROS1等致病基因同时存在，但常与TP53突变、CDKN2A/B缺失以及MET、MDM2或CDK4/6扩增共存。研究表明，MET 14外显子跳跃突变的NSCLC可对MET酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）产生应答，建议晚期NSCLC患者在二代基因测序中纳入MET 14外显子跳跃突变这一生物标志物［13］。目前，靶向MET或HGF的药物主要分为小分子TKIs和单克隆抗体。小分子TKIs又进一步细分为多激酶MET抑制剂和选择性MET抑制剂。多激酶MET抑制剂包括克唑替尼、卡博替尼、格列替尼、AMG208、奥曲替尼和戈伐替尼。选择性MET抑制剂包括ATP竞争性药物卡马替尼、特泊替尼以及非ATP竞争性药物替万替尼。单克隆抗体分为抗MET抗体奥那妥组单抗、依玛妥珠单抗与抗HGF抗体非拉妥组单抗、利妥木单抗。这些靶向药物在NSCLC治疗中具有非常广阔的应用前景［14］。

2.2.LDC GLDC是一种与细胞代谢有关的致癌基因，定位于人染色体9p24.1。由人类GLDC编码的P蛋白是甘氨酸裂解系统的关键酶，能够分解代谢甘氨酸生成5，10-亚甲基四氢叶酸，从而参与细胞甘氨酸代谢。GLDCV1是GLDC的可变剪切异构体，其外显子1的3'端49～448位点缺失400 bp。与GLDC全长cDNA产物相比，GLDCV1在194位点丢失了原始ATG序列。GLDC全长cDNA产物GLDCf1及其剪切变体GLDCV1过表达可促进正常肺成纤维细胞p-ERK、p-p38、Cyclin D1表达，从而发挥促癌作用［15］。GLDC可通过外显子跳跃方式来空间位阻反义寡核苷酸shAON，抑制NSCLC细胞GLDC过表达。在GLDC-shAON的肿瘤组织中，丙酮酸向乳酸的转化水平显著降低，丙酮酸脱氢酶和乳酸脱氢酶活性降低，细胞外酸化速率明显受到抑制，顺铂的治疗效果也随之增强。这表明GLDC-shAON或可与常规化疗药物联合应用，从而增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［16］。在预后方面，GLDC过表达NSCLC患者的死亡风险是其低表达NSCLC患者的4倍。在与甘氨酸代谢有关的肿瘤中，应用高毒性抗叶酸药物甲氨蝶呤可能有效。联合应用抗叶酸药物与GLDC表达抑制剂或寻找甘氨酸裂解复合物特异性抗叶酸药物，类似于在靶向治疗中寻找激酶特异性抑制剂，或可成为更有效的靶向治疗策略［17］。

2.3.BM RBM是一类RNA结合蛋白，包含RNA识别基序、RNA结合结构域和核糖核蛋白基序，可参与RNA代谢，包括剪切、转运、翻译及其稳定性。研究发现，RBM结合蛋白家族成员RBM异常表达和功能失调与肿瘤的发生、发展密切相关。目前，已知的RBM超过50种。本文着重介绍具有潜在临床应用价值的RBM5和RBM10。

2.3.1.BM5 RBM5定位于人染色体3p21.3，是近年新发现的一种抑癌基因。在超过90%小细胞肺癌（SCLC）和50%～80% NSCLC患者中可检测到RBM5缺失。RBM5的前体mRNA发生可变剪切后产生至少三种蛋白质编码变体，至少一种反义非编码RNA在RBM5内发生转录，激活线粒体细胞相关凋亡途径，包括胱天蛋白酶2和细胞表面死亡受体Fas，从而调节细胞凋亡。RBM5蛋白可参与细胞凋亡过程，与促凋亡蛋白Bax表达上调和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达下调有关。RBM5蛋白还能抑制细胞周期蛋白A表达，诱导细胞周期G1期阻滞。此外，在顺铂耐药的肺腺癌细胞中，RBM5蛋白还能增强肺腺癌细胞对顺铂的化疗敏感性。因此，涉及RBM5的靶向治疗策略有可能成为NSCLC的有效治疗方法［18］。

2.3.2.BM10 RBM10定位于人X染色体p11.3，其转录体包含24个外显子。RBM10蛋白含930个氨基酸，是一种肿瘤抑制因子，能够降低Bcl-x的Bcl-xS亚型与Bcl-xL亚型比例，导致自身基因失活，减少EGFR抑制剂介导的细胞凋亡，而其缺乏是对EGFR抑制剂治疗反应不佳的标志［19］。RBM10蛋白可结合353种长链非编码RNA（lncRNA），与核富集丰度转录物1（Neat1）有4个结合位点。RBM10蛋白主要位于Neat1的剪切异构体Neat1_2上，而Neat1具有致癌作用。在RBM10蛋白过表达的NSCLC中，Neatl_1比例增加，Neatl_2比例降低，说明RBM10蛋白通过可变剪切调节Neat1两种可变剪切异构体的平衡，并通过PTEN/PI3K/Akt/mTOR信号通路降低Neat1_2表达，抑制NSCLC细胞的侵袭和迁移［20］。此外，RBM10蛋白截短突变常见于EGFR L858R突变的NSCLC患者，这部分患者对EGFR抑制剂的敏感性降低，其临床结局通常比EGFR exon19 del缺失的NSCLC患者差，并且肿瘤进展率高［19］。

2.4.cl-xL 根据功能不同，Bcl-2家族蛋白可分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两种。其中，Bax为促凋亡蛋白，而Bcl-2、Bcl-xL为抗凋亡蛋白。Bcl-xL可结合Bcl-2家族的促凋亡蛋白，如Bax、Bad，从而阻止促凋亡离子通道开放，抑制凋亡信号激活。选择性抑制Bcl-xL可提高多西他赛在NSCLC中的临床疗效，并且不会引起明显的骨髓毒性。但是，由于Bcl-xL选择性抑制剂的临床疗效有限，目前还没有药物进入临床试验。研究表明，无法进入线粒体导致脱靶是Bcl-xL选择性抑制剂A-1331852在实体瘤中疗效不佳的重要原因。线粒体无毒小分子NA-2a通过转运蛋白选择性聚集在线粒体中，改变了线粒体膜的通透性，从而促进A-1331852进入线粒体并与其靶点结合，增加抗肿瘤活性。因此，NA-2a联合A-1331852成为一种有前景的NSCLC治疗选择［21］。新型Bcl-2/Bcl-xL双抑制剂APG1252-M与第三代EGFR抑制剂奥希替尼联合使用，能够诱导EGFR突变的NSCLC细胞凋亡，降低奥希替尼获得性耐药概率，有效抑制奥希替尼耐药NSCLC细胞的增殖［22］。ABT263是一种可诱导细胞凋亡的小分子Bcl-2抑制剂，能够通过靶向Bcl-2/Bcl-xL改善常氧条件下放疗对肿瘤细胞的毒性作用，克服体内外暴露于急性或循环缺氧肿瘤细胞的放疗抗性［23］。在高分化和中分化肺鳞癌中Bcl-xS表达显著升高，其高表达与较高的总生存率显著相关，是手术切除肺鳞癌患者预后良好的独立预测因素［24］。

2.5.RSF SRSF是一类富丝氨酸/精氨酸的剪切因子，具有相似的结构域，即N末端的RNA识别结构域和C末端的富丝氨酸/精氨酸结构域。本文着重介绍SRSF5、SRSF9两种最具临床价值的可变剪切体。

2.5.1.RSF5 SRSF5参与前体mRNA的可变剪切及翻译过程，其编码蛋白在多种肿瘤中异常表达。SRSF5蛋白在肺癌中表达上调，尤其是在SCLC中的表达显著高于肺腺癌或肺鳞癌。SRSF5蛋白对NSCLC胸腔积液中恶性细胞的鉴别诊断价值较高，优于临床常用的肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）。SRSF5蛋白还能检出CEA假阴性中70%非NSCLC患者。这提示SRSF5蛋白或可作为一种检测SCLC和胸膜转移的新型标志物［25］。

2.5.2.RSF9 SRSF9定位于人12号染色体，其编码蛋白在脑、结肠、肺及皮肤等部位恶性肿瘤组织中高表达。在肺腺癌中，SRSF9蛋白高表达与肿瘤突变负荷及患者总生存期呈正相关关系，这为肺腺癌预后评估提供了新的思路；在肺鳞癌中，SRSF9蛋白表达与B细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、巨噬细胞等六种免疫浸润细胞呈负相关关系，而与肿瘤纯度呈正相关关系，提示SRSF9可能通过免疫抑制作用影响肺鳞癌进展。因此，SRSF9在NSCLC免疫治疗和预后评估方面表现出一定优势［26］。

2.6.DD3 细胞骨架基因在调节肿瘤细胞生长和迁移中起关键作用。Adducin属于膜骨架蛋白家族，由ADD1、ADD2和ADD3编码，分别映射至染色体三个不同位置，其中ADD3编码蛋白对维持细胞骨架至关重要。ADD3定位于人染色体功能性肿瘤抑制区域10q25.1-25.2，其编码蛋白除了作为细胞骨架蛋白外，还是肿瘤细胞生长的负性调节因子，其表达变化与肿瘤恶性表型和临床预后呈负相关关系［27］。人类ADD3共有15个外显子，其中外显子14易发生可变剪切。QKI-5以位置依赖性方式与内含子13的3'端多个位点结合，抑制ADD3外显子14可变剪切，从而抑制肿瘤的发生、发展。ADD3的总mRNA水平在肿瘤组织与正常组织之间相差无几，但由于mRNA存在可变剪切这一特殊的加工方式，不同的外显子进行拼接产生不同的剪切产物。有研究报道，受肿瘤微环境的影响，ADD3外显子14表达在肺癌组织中上调1.43～3.76倍，并且其表达与患者生存期和QKI mRNA表达呈负相关关系［28］。在ADD3 16个外显子中，外显子15倾向于在NSCLC中表达，而在正常肺组织中不表达，在高转移性乳腺癌中亦有同样趋势，这表明ADD3特异性可变剪切体可能在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，或可作为一种新的肿瘤生物标志物预测肿瘤的发生、发展［29］。

综上所述，可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，可变剪切基因异常几乎与肿瘤细胞的所有特征表型有关，能够参与多种肿瘤的发生、发展以及治疗耐药。在NSCLC中的可变剪切基因主要有MET、GLDC、RBM、Bcl-xL、SRSF、ADD3等，这些可变剪切基因能够参与NSCLC细胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物学行为。近年在可变剪切领域的研究中取得了巨大进展，很大程度上促进了肿瘤靶向药物的研发。但关于NSCLC预后标志物或治疗靶点的潜在可变剪切基因还有很多，许多基于可变剪切的靶向治疗还远未进入临床试验阶段，仍需进一步探索。