周坤 林剑 莫亚峰 汤样华*

1.浙江中医药大学附属江南医院/杭州市萧山区中医院,浙江 杭州 311201

2.浙江康复医疗中心,浙江 杭州 310052

老年骨质疏松症(senile osteoporosis,SOP)是一种主要表现为骨量减少、骨小梁结构退化,导致骨的脆性增加,出现骨痛及腰背痛、驼背、易发骨折等症状的代谢性骨病[1]。并且随着人口老龄化程度的加剧,骨质疏松症的发生率也明显上升。据统计[2],2050年我国骨质疏松症患者将从2019年的6 000万增加到1.2亿以上。因此,SOP病理机制的研究对SOP的有效防治具有重要的社会价值和意义。目前研究已证实,骨形成和骨吸收失衡导致的骨量减少是SOP的主要病理机制,其中骨形成过程中又与成骨细胞增殖、外基质成熟、骨基质矿化障碍密切相关,而且可能涉及成骨细胞与不同相关信号通路之间的相互关联,但具体作用机制尚不明确。本文就成骨细胞及其介导的相关信号通路在SOP中的作用机制进行总结,以期为SOP的病理机制研究和治疗提供新的思路。

1 成骨细胞介导的骨形成与SOP的相关性

成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收是维持骨量动态平衡的关键因素。研究表明骨形成小于骨吸收,致使骨代谢处于负平衡状态、导致骨量减少是OP主要的发病机制,其中骨形成障碍是老年骨质疏松症的重要原因[3]。骨形成包括成骨细胞增殖、外基质成熟、骨基质矿化3个过程。在整个成骨细胞骨形成过程中,Wnt/β-catenin、Hedgehog、BMP-2/Smad、PI3K/AKT等是骨形成过程中主要调控信号通路,骨形成蛋白(BMP)、骨特异性碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、I型胶原蛋白(COL-1)、骨桥蛋白(OPN)等相关因子是骨形成过程中的重要参与因子。在成骨细胞增殖过程中,各种原始细胞分化为成骨细胞,体内BMP-2/smad信号通路是此过程的关键通路,BMP-2不仅能够有效增加成骨细胞数量,还能与Wnt/β-catenin、Hedgehog通路产生协同作用以提高ALP的活性,而ALP活性的高低与下阶段成骨细胞分化程度呈正相关[4]。另外Wnt/β-catenin通路抑制间充质干细胞分化为脂肪细胞,从而增加成骨细胞数量。在外基质形成与成熟过程则以Runx2为关键因子,Wnt/β-catenin、hedgehogBMP-2/Smad等通路通过下游因子Runx2调控成骨细胞增殖并分泌COL-1,大量累积的COL-1与其他细胞、因子共同作用,促进骨基质的合成与骨雏形的形成,同时ALP和COL-1共同促使成骨细胞外基质成熟,为其他基质组分如羟基磷灰石的沉积提供有机支架[5]。在骨基质矿化过程中,Runx2相关信号通路如Wnt/β-catenin、BMP-2/Smad、PI3K/AKT等参与成骨细胞分化成熟且促进分泌骨矿化调节剂OCN,当有机支架富含OCN时,大量ALP通过分解磷酸酯中的无机磷,同时BMP-2/Smad等信号通路调节OPN等因子促使成熟外基质中的羟基磷灰石沉积,促进基质发生矿化,矿物质沉积促使骨质形成[6-7]。临床及相关实验研究证实骨形成过程中的任何阶段受阻,都有可能引起骨形成障碍从而导致骨质疏松的发生。Xue等[8]通过抑制骨质疏松模型大鼠成骨细胞增殖过程,发现其ALP活性降低,成骨细胞分化减弱,大鼠骨质疏松程度加重。Paschalis 等[9]在临床研究中发现药物治疗可诱导骨质疏松症患者外基质成熟与骨基质矿化,提高骨强度,改善骨质疏松。对于老年人群,细胞衰老、营养状况等因素会导致成骨细胞、骨髓细胞和骨祖细胞等活性减少,影响外基质成熟与骨基质矿化等骨形成过程,从而导致SOP的发生[10]。

2 成骨细胞介导的相关信号通路与SOP的发生、发展

2.1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin通路在骨稳态和骨修复中起着重要作用。Wnt蛋白由19个分泌糖蛋白组成,具有调控细胞生长、分化和凋亡的功能[11]。Wnt蛋白、卷曲受体(Frizzled)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6(LRP5/6)发生结合,形成Wnt-FZF-LRP5/6复合体,复合物形成后,LRP5/6的羧基端与Axin结合,从蛋白复合体中释放β-catenin,使GSK-3β无法磷酸化β-catenin,GSK-3β的失活诱导β-catenin的细胞质积累,然后易位到细胞核并激活T细胞因子/淋巴增强因子(TCF / LEF)家族,激活β-catenin的转录[12]。激活后的Wnt/β-catenin发出信号,通过包括干细胞更新、诱导成骨细胞生成以及抑制成骨细胞凋亡等多种机制促进成骨[13]。

已有研究证实,Wnt/β-catenin信号通路在调控成骨过程中,Wnt3a、Wnt6、Wnt10a、Wnt10b、Wnt5A和β-catenin是必需的关键成分,缺失可导致骨质减少[14-15]。Wnt信号传导通过抑制脂肪生成转录因子、增强子结合蛋白α和过氧化物酶体增殖物激活的受体γ(PPARγ)来维持前脂肪细胞处于未分化状态[16]。在早期研究中,Wnt10b因子已被证明是骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)的命运调节剂,Wnt10b的异位表达可以抑制脂肪生成转录因子从而抑制BMSC分化为脂肪细胞,使更多的BMSC向成骨细胞分化[17]。后续研究中发现,Wnt信号通路中Wnt6、Wnt10a也有相似的作用[18]。近期发现,Wnt6、Wnt10a在刺激BMSC分化为成骨细胞时,实验底物中ALP、OCN、成骨细胞特异性转录因子(Osx)表达明显提高,这些因子都是骨形成过程中的关键因子,间接证明了wnt/β-catenin信号通路可以促进成骨细胞分化、增殖和矿化活动[19]。随着研究深入,实验底物中ALP、OCN的表达含量上升或许归功于BMP,相关研究证明BMP-2通过诱导Wnt1、Wnt3a、Lrp5表达和抑制β-TrCP的表达来促进规范Wnt信号传导[20]。与之相对应的是Wnt3a激活Wnt信号传导或β-catenin/TCF4的过表达又可以刺激了BMP-2的转录,这代表着BMP和Wnt/ β-catenin在成骨细胞分化和成熟期间存在相互合作的关系。尽管Wnt /β-catenin信号通路与BMP协调可以表现出更强的调节成骨分化的能力[21],但是BMP-2的转录调控是复杂的,涉及多种途径如hedgehog、PTH / CREB信号通路,这些途径与Wnt信号通路在控制成骨细胞分化和骨稳态方面发生干扰。故Wnt/β-catenin信号通路与BMP之间的调控关系仍需进一步研究。此外,Wnt/β-catenin通路激活过程中TCF-1与Runx2调节区域结合,可通过Runx2来促进骨形成。Yang等[22]在近期实验中发现Wnt7a过表达增加了Runx2启动子活性,提高OCN分泌,促进骨基质矿化。

综上表明,Wnt/β-catenin信号通路对SOP骨形成过程的作用主要为以下3个方面:(1)直接抑制BMSC分化为脂肪细胞,促进BMSC分化为成骨细胞;(2)与BMP协同作用增强ALP等成骨关键因子活性,促进成骨细胞分化、增殖和矿化活动;(3)通过调节关键的成骨调节因子Runx2调节成骨分化。

2.2 Hedghog信号通路

Hedgehog是一种高度保守的分泌性糖蛋白,负责调节胚胎发育、细胞增殖分化以及维持组织稳态。Hedgehog同源蛋白分为Shh、Ihh、Dhh三类,其中shh、ihh对成骨分化具有重要作用。Hedgehog信号通路主要由Hedgehog配体、Ptched受体、Smo受体、Gli转录因子等组成。Hedgehog配体在跨膜转运蛋白的帮助下从细胞中释放出来,使hedghog与ptched受体结合,解除ptched对Smo的抑制,促进Smo释放Gli转录因子,进而激活Hedgehog信号通路[23]。研究表明,Shh通过提升Gli2转录刺激BMP-2表达以增强成骨细胞分化[24]。Wu等[25]通过特定方式将Shh移植到BMP-2的培养基上,观察到相较于没有BMP-2的培养基大鼠成骨细胞分化的能力更突出。Jiang等[26]的实验发现激活Shh信号通路后,大鼠体内BMP表达水平明显升高,同时ALP活性与基质矿化结节的数量增加。Ihh可以抑制PTHrP生成,并与其形成负反馈调节,控制Ihh的过度表达,抑制骨和软骨内的过度发育,确保成骨处于动态平衡状态,从而达到促进骨基质矿化,增强骨形成的能力[27]。

另外,目前主流观点认为Hedgehog信号通路还通过干预Runx2表达对骨形成起促进作用。如AlMuraikhi[28]发现用Smo拮抗剂抑制Hedgehog信号通路后,小鼠体内Runx2和 Osx的表达同时减低,小鼠成骨细胞分化、矿化等功能受到抑制。Moon等[29]研究也发现,Hedgehog拮抗剂Cyclo有效地抑制了成骨细胞的分化,而促进剂则增加了Runx2及骨骼生成标志物ALP的表达,并增强了小鼠外基质矿化能力。Wang等[30]通过激活hedgehog受体调节Gli1表达,强化了Runx2表达,同样使ALP数量及钙结节形成增加。此外,成骨细胞抑制剂PTH相关肽(PTHrP)可以抑制早期Hedgehog与BMP诱导的成骨作用,并在间接反应中阻止Runx2表达的上调,导致OCN分泌减少,基质矿化受阻。

综上表明,激活的Hedgehog信号通路对SOP骨形成作用主要分为以下3个方面:(1)与BMP协同作用影响间充质干细胞分化成骨细胞;(2)通过提高Runx2和Osx的表达,调节COL-1与ALP含量,促进成骨细胞外基质形成与骨基质矿化;(3)与PTHrP形成负反馈调节,抑制骨与软骨过度发育,促进骨形成。进而表明Hedgehog信号通路对骨形成三个阶段都有相关调节作用,是防治SOP的可能目标通路。

2.3 BMP-2/Smad信号通路

BMP属于转化生长因子-β(TGF-β)家族的最大成员,BMP通过与I型和II型的丝氨酸/苏氨酸激酶受体相互作用来发挥其生物学功能。来自I型受体的信号,当被II型受体磷酸化时,被各种分子传递到下游底物,通过Smad信号传导激活靶基因。在BMP和TGF-β信号由细胞膜传递至细胞核的过程中,Smad蛋白起到了关键性的作用。活化的I型受体进一步磷酸化Smad蛋白,促使Smad分子从细胞膜受体上脱离下来,并在胞质内结合Smad4分子然后将复合物易位到细胞核中,与其他核辅助因子如ALP一起调节靶基因的转录,同时触发Runx2转录[31-32]。

现有研究证实BMP是成骨细胞分化的关键蛋白,其中BMP-2又是最有效的细胞因子之一,并能诱导骨形成[33]。若BMP-2因子缺失将导致超过90 %的突变间充质祖细胞保持未分化。BMP-2还能显著增加骨桥蛋白基因表达,诱导基质成熟,调节细胞外基质中的羟基磷灰石沉积。宋敏等[34]利用特定中药相关物质激活BMP-2/Smad信号通路,发现激活组与对照组相比大鼠OPN基因显著表达,成骨标志蛋白BMP、COL-1显著增加。在促进成骨过程中,BMP-2通过激活Smad信号传导触发Runx2的转录来调控骨形成不同阶段。已有大量实验证实了BMP-2/Smad信号通路的相关作用机制,如柴姗等[35]通过动物实验发现,抑制BMP-2/Smads信号通路时,大鼠体内凋亡骨细胞数量增加;而上调大鼠BMP-2、Smad1和Smad5的表达时,大鼠体内Osx和Runx2的表达明显升高,表明BMP-2/Smad可能通过Runx2进一步调控其下游产物如ALP、COL-1和OCN,从而达到调节骨形成的作用。Feng等[33]的实验也发现,刺激BMP-2/Smad信号通路,OP小鼠模型血清中骨形成关键因子Runx2和Osx的mRNA水平升高。Runx2及其下游因子Osx的表达对成骨细胞分化至关重要,Osx是一种含锌指的转录因子,在成骨细胞和软骨细胞中表达,是成骨细胞分化的早期和晚期标志物,若Osx表达缺失将导致成骨细胞分化受阻,骨形成障碍。肖锐等[36]发现抑制BMP-2/Smad信号通路能够降低OCN和ALP水平,同时下调相应蛋白质浓度,减弱ALP的染色效果,并持续抑制外基质矿化及钙化结节生成。

综上表明,BMP-2/Smad信号通路对SOP骨形成作用主要通过以下3个方面:(1)促进BMSC分化成骨细胞;(2)增加OPN表达促进外基质成熟与矿化;(3)调节Runx2与Osx促进骨形成全过程。

2.4 PI3K/AKT信号通路

PI3K/AKT信号通路由一系列膜受体和生长因子激活,并在细胞能量代谢、细胞质运动和细胞周期进展中发挥关键作用,是许多系统中调节骨再生过程的关键信号通路。在信号通路中PI3K将膜磷脂肌醇-4与5-二磷酸磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸盐,PI3K被磷酸化后通过招募PDK1激活下游分子AKT,PI3K/AKT激活后通过抑制信号底物GSK-3β稳定β-catenin并使其易位到细胞核中进行基因转录并生成两种转录因子Runx2和osterix,其加速成骨细胞分化[37-38]。另外活性FoxO可以与β-catenin竞争TCF从而使Wnt信号通路激活减弱,而AKT激活后能磷酸化FoxO的Thr-24,Ser-25和Ser-319位点,促使磷酸化后的FoxO与衔接蛋白14-3-3结合,促进FoxO向细胞质聚集及降解,从而使得FoxO丧失活性,促进Wnt的骨形成作用[39]。

PI3K/AKT信号通路可促进成骨细胞分化。LI等[40]的实验证明利用arctigenin激活PI3K/AKT信号通路后,其通过调控PPARγ表达,成骨细胞分化能力得到加强,并且实验底物中Ca和P丢失减少,实验小鼠骨密度增强。PI3K/AKT信号通路还能通过β-catenin调控Runx2和osterix达到调节骨形成的作用。最新研究发现,巨噬细胞MSR1在胫骨单皮质缺陷模型小鼠中通过介导的PI3K/AKT信号通路,增加了模型小鼠体内ALP与Runx2的活性,使成骨标记基因COL-1与OCN的mRNA表达水平大幅升高,促进成骨分化的能力[41]。此外PI3K/AKT在BMP-2/smad信号通路促进骨形成过程中起重要作用。DONG等[42]做的最新体外实验证明PI3K选择性抑制剂LY294002阻断PI3K信号通路后,BMP2诱导的成骨细胞生成被阻断,外基质成熟与矿化受阻,同时发现另一相关因子PTEN阻断BMP-2信号通路后PI3K/AKT信号通路被激活,骨形成得到促进 。在机体氧化应激时PI3K/AKT可以抑制FoxO达到促骨形成。AKT磷酸化FoxO的关键位点,使FoxO降解失活,抑制其对Wnt信号通路的竞争作用;并且AKT还能够磷酸化FoxO3a,阻止其向细胞核聚集,使得反式激活其下游靶基因成骨细胞中的前凋亡分子遭到破坏,进而抑制了成骨凋亡[43]。

综上表明,PI3K/AKT信号通路对SOP骨形成作用主要通过以下4个方面:(1)调控PPARγ的表达,促进骨前体细胞向成骨细胞分化;(2)通过直接通过Runx2促进成骨细胞分化、增殖与矿化:(3)协同BMP维持BMP-2/smad信号通路活性以促骨形成;(4)抑制FoxO因子使Wnt/β-cantenin信号通路促骨形成功能正常。

3 结语与展望

促进骨形成是防治SOP的重要途径之一,明确骨形成过程中成骨细胞与SOP的相关性及其相关信号通路的调控作用机制,具有重要研究意义。目前调控成骨细胞的相关信号通路主要有Wnt/β-catenin、Hedgehog、BMP-2/smad、PI3K/AKT,本文阐述了成骨细胞介导这些信号通路在老年骨质疏松中调控成骨的作用机制,证实了成骨细胞及其介导的信号通路在骨质疏松症发病进程中的作用,对SOP的防治具有重要的临床价值,或将为SOP的临床治疗提供新的靶点。但是各条信号通路对成骨细胞的协同调控作用机制仍未被完全揭示,是否可通过多条信号通路共同调控成骨细胞促进成骨防治SOP,是否因其对关键转录因子(如Runx2)的不同调节作用而产生治疗效果的差异,尚待进一步研究。