何姣姣 陈玉林 张敏陈以发 杨雅*

1.南昌大学第二附属医院内分泌代谢科,江西 南昌 330006

2.赣州市人民医院内分泌代谢科,江西 赣州 341000

骨质疏松症是由于骨吸收大于骨形成引起的全身性骨病,骨密度的减低及骨微结构的破坏导致骨质疏松症患者骨折的风险极高,严重影响患者生活质量及生命健康。据统计,全球约有2亿女性骨质疏松症患者,随着年龄增加骨质疏松症的患病率逐渐上升[1]。人口老龄化使得骨质疏松症给全世界带来了沉重的医疗负担及经济负担。在哺乳动物肠道中含有大量而丰富的微生物群,包括细菌、病毒、真菌和原生动物,统称为肠道微生物群。肠道中约含有100万亿个微生物,目前已知有上千种细菌在人类胃肠道内定殖[2]。近年来,随着对骨质疏松症发病机制的深入研究,人们发现肠道菌群在骨质疏松症的发病机制中发挥着重要作用[3]。

1 骨免疫学与微生物-肠-骨轴

骨质疏松症是一种以慢性低度炎症为特征的全身性疾病,免疫细胞、细胞因子及趋化因子与骨质疏松症密切相关,免疫系统对骨转换的影响常常表现为 B、T细胞激活,白介素-17(interleukin-17,IL-17)、IL-6及核因子κ-B 配体激活受体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)等促骨吸收因子增多[4]。肠道菌群主要通过引起免疫系统以下几个方面的变化来调节骨代谢。

1.1 T细胞

雌激素缺乏可增加肠道通透性,导致肠道微生物成分激活T细胞并使得肠壁中的TNF+T细胞和辅助T细胞17(T helper 17 cells, Th17)细胞增多,从而增加肠壁固有层中TNF和IL-17的产生[5]。去卵巢小鼠肠道总T细胞、TNF+T细胞和Th17细胞从肠组织迁移到骨髓[6]。TNF水平的增加可能上调骨髓细胞CCL20的表达,Th17细胞向骨髓的归巢由趋化因子配体CCL20(由骨髓基质细胞表达)和趋化因子受体CCR6(由Th17细胞表达)驱动。而TNF+T细胞向骨髓的归巢是由趋化因子受体CXCR3驱动的,该受体与其配体CXCL9、CXCL10和CXCL11结合[6]。

1.2 Treg-Th17细胞平衡

调节性T细胞(regulatory cells,Tregs)是CD4+T细胞一个子集,其表面的CTLA-4与破骨细胞前体细胞CD80/CD86结合,促进破骨细胞的凋亡,具有骨保护作用[7]。另一CD4+T细胞亚群Th17主要通过产生破骨细胞生成因子,如IL-17A、RANKL、TNF-α和IL-6,以及低水平的γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)发挥作用介导骨丢失[8]。Treg-Th17细胞之间的平衡对骨量的维持具有重要作用。嗜酸乳杆菌和克劳斯芽孢杆菌被证明通过调节Treg-Th17细胞之间的平衡来抑制去卵巢诱导的小鼠骨丢失。克劳氏芽孢杆菌通过调节Treg-Th17细胞之间的平衡,降低促炎细胞因子(IL-6、IL-17和TNF-α)的水平,增加抗炎细胞因子(IL10和IFN-γ)的水平发挥作用[9]。

1.3 促炎性破骨细胞因子

年老的小鼠肠道菌群的改变会降低骨量,破坏骨强度[3]。肠道菌群在绝经后骨质疏松症的发病机制中亦发挥着重要作用。与正常小鼠相比,去卵巢小鼠的小肠促炎细胞因子(包括IL-1、IL-6和TNFα、IL-17)显著增加,而去卵巢小鼠经口灌胃短乳杆菌AR281显著抑制IL-1、IL-6和TNFα、IL-17的水平[10]。促炎破骨细胞主要通过RANKL/骨保护素(osteoprotegerin,OPG)影响骨吸收。普通双歧杆菌降低脂多糖浓度并导致TLR-4/p-NF-κB/TNF-α炎症通路的下调,进一步改善卵巢切除小鼠的腰椎骨质流失[11]。

2 环境与微生物-肠-骨轴

人类的生命活动与环境密切相关,特别是光照及温度的影响。

2.1 光照

紫外线辐射(ultraviolet radiation,UVR)和红外辐射(infrared light,IR)是阳光光谱中主要的健康光区域。既往认为紫外线照射能够通过增加内源性维生素D的生成维持骨骼健康[12]。近年来有研究[13]发现窄谱紫外线在增加维生素D生成的同时可以快速调节肠道微生物群,血清25(OH)D浓度与乳杆菌属的相对丰度呈正相关。考虑其机制可能是皮肤微生物组在窄谱紫外线的辐射下发生变化,导致先天性和适应性免疫细胞的局部变化,然后将这些细胞运送到肠道进而影响肠道菌群。同时研究[14]发现红外线可诱导丹毒丝菌科、梭菌科和卟啉单孢科增加,并通过抑制炎症及增加丁酸的生成改善骨代谢。

2.2 温度

温暖(34 ℃)的环境诱导肠道微生物群变化,如阿克曼菌科,并且与骨密度的升高有关[15]。此外有研究发现,温暖环境中饲养的小鼠粪便中移植微生物群能够防止卵巢切除引起的小鼠骨质流失。研究发现阿克曼菌科定殖的增加触发了亚精胺的产生,亚精胺属于骨保护剂,多胺生物合成抑制剂能阻断温热对性腺功能减退小鼠的骨保护作用[16]。

3 营养素与微生物-肠-骨轴

微量营养素的补充与肠道菌群的调节相互影响骨代谢的发挥作用。钙剂的补充是骨质疏松症患者的基础治疗。补充钙剂会引起肠道微生物种类及其代谢产物谱的变化。钙剂补充增加了肠道厚壁菌门丰度,并使拟杆菌门丰度降低[17]。维生素D对葡萄球菌和埃舍利希菌具有抑制作用,并且能促进拟杆菌等有益细菌定殖[18]。盲肠、肝脏和肾脏中的维生素K含量主要由微生物衍生的甲基萘醌甲基萘醌(menaquinones,MK5-13)组成,约占维生素K总含量的83.3 % ～ 99.9 %。维生素K依赖的γ羧基化是含Gla的蛋白质与骨组织正确结合所必需的。肠道微生物群破坏小鼠的盲肠维生素K总含量较低。在盲肠,肠道微生物群的破坏导致存在的维生素K的形式发生剧烈变化(MK10和MK11减少,MK7和MK8增加)[19]。钙剂、维生素D、维生素K这些微量营养素与肠道菌群相互作用以调节骨质量。

4 黏膜屏障与微生物-肠-骨轴

肠道粘膜屏障是人体内与外环境的交界面,肠道粘膜的完整性对于防止有害物质(如毒素、细菌)进入体内具有重要意义[20]。肠道菌群可以通过影响粘膜屏障功能影响骨代谢。脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)是一种内毒素,是革兰氏阴性菌外膜的重要组成部分。在经RANKL或LPS处理的原代细胞中可以观察到Toll样受体4(TLR4)的膜水平增加,内毒素/TLR4信号途径分泌的肿瘤坏死因子-α可调节RANKL诱导的破骨细胞的生成[21]。可见在炎症性骨病中脂多糖/TLR4/肿瘤坏死因子α轴对破骨细胞的分化具有重要意义。肠道粘膜的完整性可防止细菌脂多糖接触固有层中的巨噬细胞TLR-4,防止骨质疏松症[11]。短乳杆菌AR281能够抑制由雌激素缺乏引起的肠道紧密连接蛋白表达水平显著下调,包括claudin-2、claudin-3、ZO1和occludin[10]。肠道微生物对肠道粘膜屏障的影响也被证实其参与了糖皮质激素诱导的骨质疏松症[22]。

5 肠道菌群代谢物与微生物-肠-骨轴

肠道微生物群通过多种代谢产物调节宿主炎症状态,从而影响多种疾病,如类风湿关节炎、结直肠癌、肥胖和糖尿病[23]。近年来,肠道微生物组的变化同样被证明与骨相关疾病有关,如骨关节炎和绝经后骨质疏松症[24]。胞外多糖(exopoly saccharides,EPS)是一种由细菌产生、存在于细胞表面的结构中并可以分泌至胞外的长多糖链[25]。一种双歧杆菌-长双歧杆菌(B. longum),其表面的EPS624被认为通过单核细胞来源的树突状细胞中TLR2信号抑制破骨细胞形成从而预防绝经后骨质疏松症的发生[26]。其他肠道菌群的诸多代谢产物亦被证明具有重要的骨代谢调节作用。

5.1 尿石素-A

尿石素-A(urolithin A ,Uro-A)是一种天然的肠道微生物衍生代谢产物,由摄入的鞣花单宁和鞣花酸产生。然而,只有40 %的老年人能够将膳食纤维转化为Uro-A[27]。这种转化取决于个人肠道菌群的属性、生物健康状况和饮食习惯。Uro-A被证明具有抗炎、抗氧化作用[28]。Uro-A可以通过下调炎症级联反应来减轻RAW264.7诱导的破骨细胞形成[29]。目前认为RANKL诱导体外破骨细胞生成中Uro-A通过增强的自噬作用抑制骨吸收,并通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase ,MAPK )信号通路进而抑制破骨细胞的形成[30]。

5.2 短链脂肪酸

短链脂肪酸(short-chain fatty acids ,SCFA)由肠道细菌通过非消化性多糖发酵产生,与宿主免疫系统的成熟有关,包括诱导外周调节性T细胞、防止感染、调节代谢率和能量稳态[31]。人类短链脂肪酸的主要来源于食物纤维以及肽和蛋白质在肠道内微生物发酵,其中丁酸、丙酸和醋酸盐占结肠中SCFA总量的90 %[32]。SCFA诱导破骨细胞的代谢重编程,导致以氧化磷酸化为代价的糖酵解增强,从而下调必要的破骨细胞基因,如TRAF6和NFATc1直接抑制破骨细胞活性[33];醋酸盐可上调MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶mRNA的表达,具有促进成骨细胞分化的能力[34]。而丁酸被认为是iPTH促进骨合成代谢所必需的,丁酸增强了iPTH诱导原始CD4+T细胞分化为Tregs的能力,而Tregs能诱导CD8+T细胞释放Wnt10b激活成骨细胞中的Wnt信号刺激骨形成[35]。

5.3 吲哚-3-丙酸

吲哚-3-丙酸(indolepropionic acid ,IPA)是一种肠道微生物群衍生的色氨酸代谢产物。有研究发现补充益生菌可提高吲哚-3-丙酸水平,防止肥胖小鼠的肠道炎症和并通过紧密连接蛋白(ZO-1、ocludin和Claudin-5)的表达影响肠道通透性;IPA通过增加组蛋白脱甲基酶Kdm6b的结合和降低H3K27 me3与Tfam启动子的结合来增强线粒体转录激活因子Tfam,从而促进成骨细胞分化;此外,IPA可以抑制TLR4受体的表达,并防止内毒素诱导的成骨细胞功能障碍[36]。

5.4 胆汁酸

法尼醇X受体(farnesoid x receptor ,FXR)是由胆汁酸(bile acids,BAs)直接激活的核受体,胆汁酸也是膜结合的G蛋白偶联胆汁酸受体1(G-protein coupled bile acid receptor 1 ,GPBAR1)又称为TGR5的配体,FXR和TGR5调节糖、脂和能量代谢[37]。近年来有研究[38]发现,骨质疏松症导致胆汁酸分泌增加,胆汁酸对肠道细菌的抗菌作用导致肠道菌群物种丰度的变化,这种作用可能会增加胆汁酸代谢菌群,减少胆汁酸敏感菌群,进而影响胆汁酸肠道代谢,影响血清胆汁酸浓度,最终影响破骨细胞活性并导致骨量损失。TGR5通过AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase ,AMPK)信号通路抑制破骨细胞分化,TGR5和FXR双重激活可有效改善小鼠雌激素缺乏引起的骨丢失[39]。

6 内分泌骨信号因子与微生物-肠-骨轴

6.1 雌激素

基础及临床试验均证明,雌激素缺乏性骨质疏松症患者表现出明显的肠道菌群改变[6,40]。重建小鼠肠道菌群显示出对绝经后骨质疏松症的益处。例如,补充短乳杆菌AR281重建去卵巢小鼠的肠道菌群可通过减轻骨吸收发挥抗骨质疏松症作用。核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通过激活c-Fos和活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)调节RANKL诱导的破骨细胞前体细胞分化[41]。短乳杆菌AR281不仅通过抑制促炎性破骨细胞因子调节RANKL/OPG比值,在RANKL和RANK结合后,可通过TRAF6/NF-κB/NFATc-1途径抑制破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞[10]。

6.2 PTH

甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)是一种由甲状旁腺合成的促钙激素。间歇性注射PTH(intermittent PTH treat-ment,iPTH) 能够刺激骨形成和骨吸收, 在调节骨骼发育和成熟中发挥重要作用。有研究[42]证明这一作用依赖于肠道菌群及其代谢产物,iPTH需要生理浓度的丁酸调节Treg并诱导骨合成代谢。同时iPTH需要微生物群来增加骨髓中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β1)和胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor- 1,IGF-1)的产生,在用广谱抗生素去除微生物群后的无菌雌性小鼠中,iPTH无法诱导骨形成。

6.3 5-羟色胺

肠道内分泌细胞共同构成体内最大的内分泌组织。这些细胞分散在胃肠道上皮内,约占胃肠道所有细胞的1%。它们由一系列不同类型的细胞组成。胃肠粘膜内的肠嗜铬细胞(enterochromaffin cell,EC)是专门的肠内分泌细胞,合成和分泌全身90 % ～ 95 %的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)[43]。长期摄入酒精可改变肠道微生物组成,导致5-HT分泌增多,进而显著抑制BMSCs的成骨活性和骨矿化导致骨质疏松症[44]。细胞内5-HT受体6(5-HT receptors 6,5-HT6R)信号与RhoA GTP酶激活有关并参与破骨细胞的成熟,抑制5-HT6R介导的RhoA GTPase信号对卵巢切除小鼠骨丢失具有保护作用[45]。肠源性5-HT是微生物调节骨内稳态的重要中间因素。

6.4 胰岛素样生长因子-1

胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor- 1,IGF-1)是一种调节生长的重要内分泌激素,可通过Wnt/β-catenin途径促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖和成骨分化,对骨累积和成熟至关重要[46]。抗生素治疗引起的重复性轻度创伤性脑损伤(RmTBI)会导致GH分泌异常,最终中断GH/IGF-1轴影响骨骼发育[47]。广谱抗生素或万古霉素可降低无特定病原体(specific pathogen Free,SPF)小鼠的血清IGF-1水平,微生物群定殖后肠道细菌衍生的SCFA诱导肝脏和脂肪组织产生IGF-1,增加循环IGF-1水平从而促进骨形成[48]。

综上所述,环境、营养物质、肠粘膜屏障、肠道代谢产物、内分泌激素、免疫对骨代谢的影响与肠道菌群的调节息息相关。益生菌可维持肠道粘膜屏障完整性,减少细菌及毒素导致的集体免疫激活从而发挥骨保护作用,其产生的有利代谢产物如尿石素-A、短链脂肪酸等亦能发挥重要的抗骨质疏松症效应。不仅如此,环境、营养素及体内激素水平也通过肠道菌群发挥调节骨代谢的作用,肠道菌群又可以通过促进肠道内分泌激素的释放、免疫系统的激活进一步影响骨代谢。微生物-肠-骨轴为各型骨质疏松症发病机制的研究提供了新的思路。但值得注意的是,尽管肠道菌群可通过多种途径影响骨代谢,但对于不同类型的骨质疏松症其机制不尽相同,具体作用途径仍需要更多针对性的研究。总之,益生菌、益生元的补充有望作为一种廉价便利的方式应用于骨质疏松症的预防甚至是治疗当中,值得后续临床研究进一步予以证实。