郑雪雪 王淑霞 黄鹏 张辉 唐文杰 周丛

摘 要：本文采用液相色谱串联质谱法对牛奶中黄体酮残留量进行分析测定。结果表明，当牛奶中黄体酮残留量测定含量为6.93 µg·kg-1时，其扩展不确定度达到1.82 µg·kg-1（k=2）。该方法的不确定度主要来自校准过程产生的不确定度，可对相关计量器具进行检定以改善。

关键词：黄体酮；液相色谱串联质谱；牛奶；不确定度

Abstract： This article uses a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to determine the residual amount of progesterone in milk. The results showed that when the content of progesterone residue in milk was 6.93 µg·kg-1， the expanded uncertainty reached 1.82 µg·kg-1（k=2）. The uncertainty of this method mainly comes from the uncertainty generated during the calibration process， and relevant measuring instruments can be verified to improve the accuracy

Keywords： progesterone; liquid chromatography tandem mass spectrometry; milk; uncertainty

黄体酮是由雌性的卵巢黄体分泌，是一种孕激素。为保障生育所需要，黄体酮在生物体内对维护子宫内膜正常功能发挥着重要作用，在生理临床治疗中应用广泛[1-2]。研究表明，長期食用含孕激素的食品，易造成内分泌紊乱，损害生殖器官，增加子宫内膜发生病变及患上乳腺肿瘤的风险[3-4]。牛奶作为广受人们欢迎的消费品，其膳食摄入占比较大，由此带来的风险不容忽视，因此合理、准确地评估乳制品黄体酮残留量显得尤为必要，而合理准确的评估就需要对其测量不确定度的大小进行评价。

目前，黄体酮检测分析一般采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、高效液相色谱-质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等方法[5-7]。其中，高效液相色谱-质谱联用法凭借其高度灵敏性以及高准确度而被广泛用于各类样品中黄体酮的测定[8-9]。但关于采用液相色谱质谱联用法测定牛奶中黄体酮的残留量的不确定性评价方法鲜见。本文参照《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[10]、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL006： 2019）[11]以及农业部1031号公告-1-2008《动物源性食品中11种激素残留检测 液相色谱-串联质谱法》[12]等，对牛奶中黄体酮残留含量测量的不确定度进行评估，希望对评估检测结果的准确性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶样品，淘宝网购买。

黄体酮标准品（坛墨质检标准物质中心）；氘代睾酮（坛墨质检标准物质中心）；乙腈（色谱纯，美国tedia公司）；甲酸（色谱纯，美国Supelco公司）；甲醇（色谱纯，美国tedia公司）；甲醚（色谱纯，上海安谱公司）。

1.2 仪器与设备

高效液相质谱联用仪，赛默飞（中国）有限公司；TG16-WS型台式离心机，cence湘仪；电子分析天平，美国新泽西的奥豪斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

参照农业部1031号公告-1-2008《动物源性食品中11种激素残留检测 液相色谱-串联质谱法》进行样品前处理操作。准确称取实验样品5.0 g，放入50 mL离心管中，准确加入10 ng氘代睾酮内标，用5 mL水稀释样品，加入10% Na2CO3溶液3 mL与甲基叔丁基醚25 mL，振荡提取10 min，离心，取上层，残渣重复提取1次。合并两次提取液，40 ℃下氮吹至近干，加入1 mL乙腈水（体积比V/V=1∶1）溶液将残渣溶解，快速涡旋混匀后，转移至离心管中，冷冻离心后，取上清液过0.22 μm的有机滤膜，用于HPLC-MS/MS测定。样品空白按同方法处理。

1.3.2 标准曲线配制

准确称取黄体酮标准物质10 mg装入至100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得到黄体酮标准储备液，其浓度为100 µg·mL-1。再准确移取1.0 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，同时采用甲醇稀释并定容，得到黄体酮标准中间溶液，其浓度为1 µg·mL-1，再分别准确移取不同体积的标准中间溶液，加入10 ng氘代睾酮内标，得到浓度为2.0 µg·L-1、5.0 µg·L-1、10.0 µg·L-1、20.0 µg·L-1和50.0 µg·L-1，内标浓度为100 µg·L-1的黄体酮系列标准工作溶液。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 m×3 μm）；样品进样量：10 µL；流速：0.4 mL·min-1；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流动相梯度洗脱程序见表1。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源；多反应监测；正离子扫描；被测物监测离子见表2。

2 结果与分析

2.1 数学模型的建立

测定牛奶中黄体酮残留量的数学模型为

式中：X为试样中黄体酮浓度，μg·kg-1；c为试样溶液含量，μg·L-1；V为试样定容体积，mL；m为称样量，g；fr为回收率校正因子；fQ为仪器定量校准影响因子。

2.2 不确定度来源分析

针对HPLC-MS/MS法检测牛奶中黄体酮含量的分析过程进行分析，可以判断出该实验中各分量不确定度的主要来源为校准过程、测量重复性以及回收率等。

2.3 各分量不确定度的计量

2.3.1 校准过程产生的相对标准不确定度ulrel（b）

（1）黄体酮标准储备液产生的不确定度分量包括以下内容。①准确称取质量为10 mg的黄体酮标准物质于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容。由黄体酮标准品纯度所带来的不确定度，记为u（p）。由标准物质证书可知，黄体酮纯度为99.0%±0.5%，其中，偏差为±0.5%，按照均匀分布方法计算，由纯度所产生的相对不确定度为

②根据电子天平检定合格证书，天平允许偏差为±0.1 mg，按均匀分布方法计算，由标准品称量所带来的不确定度与相对标准不确定度依次为

③A级单标线的100 mL容量瓶（V1）体积容差为±0.1 mL，据矩形分布计算，其带入的不确定度为

实验室的温度在（20±5）℃波动，温度的不断变化随之会引起体积的变化，呈现出均匀分布，其中k=，甲醇体积膨胀系数为1.19×10-3/℃，故可计算出容量瓶（100 mL）因温度变化引起的体积不确定度为

容量瓶（100 mL）定容体积引入的合成相对不确定度为

（2）标准溶液配制过程因容量瓶所引入的不确定度u（VL）。①依据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）中[13]所要求的，当温度为20 ℃时，A级单标线容量瓶（100 mL）体积容差为±0.10 mL，10 mL A级单标线容量瓶体积容差为±0.02 mL，按矩形分布，则容量瓶本身引入的相对标准不确定度分别为

②温度波动引起的容量瓶体积变化。温度波动范围为（20±5）℃，呈均匀分布，k=，50%乙腈水溶液体积膨胀系数为1.37×10-3/℃，故温度波动引起的容量瓶体积变化引入的不确定度为

100 mL容量瓶和10 mL容量瓶所引入的相对标准不确定度分别为

则100 mL容量瓶和10 mL容量瓶体积的合成相对标准不确定度为

（3）移液器引入的相对标准不确定度urel（Vq）。按照《移液器检定规程》（JJG 646—2006）的要求[14]，100 µL移液器中20 µL刻度处、50 µL刻度处、100 µL刻度处的检定体积的容量允许误差依次是±8.00%、±3.00%、±2.00%，1 000 µL的移液器中200 µL刻度处、500 µL刻度处测定点的容量允许误差依次是±2.00%、±1.00%。依据矩形分布，k=，则采用不同体积规格的移液器移取不同体积溶液所引入的相对不确定度urel（Vqi）为

式中：Vi为不同移液点所对应的体积，µL；ti为容量所允许的误差；Vq为移液器体积规格，即所允许量取溶液的最大体积，µL。

移液器所引入的具体参数（含数值）以及所计算出的相对不确定度结果汇总见表3。

则移液器引入的合成相对标准不确定度为

综合上述，标准物质配制过程所引入的合成不确定度为

（4）拟合校准工作曲线所带来的相对标准不确定度urel（c0）。分别移取表3中5种不同浓度的标准溶液供HPLC-MS/MS进行分析，检测结果见表4。

采用最小二乘法原理拟合出曲线方程为

Ai=0.073 225 6cj+0.020 90，R2=0.999 9。采用该曲线方程对试样溶液进行3次平行测定，最后根据直线方程得到的试样溶液中黄体酮含量为c0=6.93 ng·mL-1，则黄体酮含量c0引入的不确度为

式中：S（A）为标准曲线所引入的标准偏差；

N为标准溶液所对应的平行测定次数，N=9；P为试样溶液的测定次数，P=3；a为标准校准曲线的截距；b为标准曲线所对应的斜率；c0为由标准曲线方程计算得出试样溶液中黄体酮的浓度，μg·L-1；c为各标准工作溶液浓度配制浓度所计算出来的算术平均值，μg·L-1；ci为各校准标准工作溶液的浓度点的配制值，μg·L-1；cj为由线性方程所计算得出的标准溶液测定值，μg·L-1；Ai为单次标准工作溶液的响应值。

则拟合校准工作曲线所带来的相对标准不确定度为

则校准过程产生的合成相对标准不确定度为

2.3.2 测量重复性产生的相对不确定度urel（X）

称取7份阴性牛奶样品（不含黄体酮）进行加标回收试验，加标量均为10.00 μg·kg-1，测定结果见表5。黄体酮的平均含量为X=9.50 μg·kg-1，标准偏差

S（X ）=0.245 μg·kg-1，故重复实验所带来的不确定度以及相对不确定度分别为

2.3.3 回收率产生的相对不确定度urel（R）

由表5计算出牛奶中黄体酮的回收率的标准偏差为S（R）=2.445%，按A类不确定评定，回收率所带入的不确定度与相对不确定度分别为

2.3.4 实验过程称量样品所带来的相对不确定度urel（m）

準确称取5 g奶粉试样，所使用电子分析天平的允许误差为±0.01 g，按矩形分布进行计算，其标准不确定度和相对标准不确定度依次为

2.3.5 样品定量体积所带来的相对不确定度urel（Vy）

按《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[14]所明示的要求，当实验室温度处于20 ℃时，1 mL移液器所对应容量允许误差为±1.0%，按矩形分布计算可得移液器容量引入的不确定度为

实验室温度处于（20±5） ℃内，一般来说，温度的改变同时伴随着体积的变化，并且呈现出均匀分布，其中k=，50%乙腈水溶液所对应的体积膨胀系数为1.37×10-3/℃，故因温度变化所引入的不确定度为

样品在定量分析时，由样品定量体积所带来的相对不确定度为

2.3.6 HPLC-MS/MS校準引入的相对不确定度urel（Q）

根据仪器校准证书，仪器的不确定度u=5%，取均匀分布（k=），则仪器校准引入的相对标准不确定度为

2.4 合成相对标准不确定度ucrel（X）

对于黄体酮不确定度的贡献大部分来自校准过程产生的不确定度与液相色谱串联质谱仪校准带入的不确定度。

则黄体酮测定过程引入的合成相对标准不确定度为

当样品中黄体酮的含量为6.93 μg·kg-1，则黄体酮含量测定不确定度为

2.5 扩展不确定度及测定结果

按照《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）中所规定[10]，取置信区间P=95%（k=2），把2.4中所求的合成不确定度与包含因子二者进行相乘从而得到测量结果的扩展不确定度U=uc（X）×k=0.908×2=1.82 μg·kg-1。故采用HPLC-MS/MS测定牛奶中黄体酮的含量结果报告表示为（6.93±1.82）μg·kg-1，k=2。

3 结论

本文利用HPLC-MS/MS对牛奶中黄体酮残留量进行检测，结果表明其不确定度主要来自校准过程产生的不确定度，其次为液相色谱串联质谱仪校准带入的不确定度、测量重复性及加标回收率。因此，试验过程中可通过提升检验技术人员的作业技术水平和完善试验仪器设备的维修保养等来降低测量不确定度，保障检测结果的准确性。

参考文献

[1]吴毅丹，任斌，陈君远，等.高效液相色谱法快速测定黄体酮血药浓度[J].中国现代药物应用，2009，3（1）：17-18.

[2]邓鸿铃，苏新国.鸡蛋中黄体酮等激素含量的检测分析研究[J].畜牧与饲料科学，2011，32（2）：55-57.

[3]高凤鸣，王凤荣.雌性激素诱发的小鼠垂体肿瘤细胞化学和电镜观察[J].癌症，1988（6）：409-412.

[4]WANG Y M，CHEN H G，SONG M，et al.Prevalence of insomnia and its risk factors in older individuals： a community-based study in four cities of Hebei Province， China[J].Sleep Med，2016，19：116-122.

[5]陈丽萍，周慧，张信，等.高效液相色谱法测定黄体酮及有关物质[J].辽宁化工，2022，51（5）：730-732.

[6]李强，黄丽杰.高效液相色谱法同时测定保健品中雌二醇和黄体酮的含量[J].现代医药卫生，2016，32（21）：3292-3294.

[7]程永红，田莉虹.液相色谱串联质谱测定动物源性食品中孕激素类药物残留[J].食品与发酵科技，2021，57（2）：161-165.

[8]吴鸳鸯，王任，陈岑.QuEChERS结合液质联用法同时测定化妆品中6种孕激素[J].中国卫生检验杂志，2021，31（13）：1554-1557.

[9]李凯华，肖曼，张玲，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中多种雄性激素和孕激素[J].食品安全质量检测学报，2020，11（15）：5068-5073.

[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.

[11]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南：CNAS—GL006—2019[EB/OL].

（2019-03-15）[2023-02-25].https：//max.book118.com/html/2019/0805/8002075142002040.shtm.

[12]中华人民共和国农业农村部.农业部1031号公告-1-2008《动物源性食品中11种激素残留检测 液相色谱-串联质谱法》[EB/OL].（2008-05-09）[2023-02-25].http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2008/dliuq/201806/t20180610_6151596.htm.

[13]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器检定规程：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.

[14]国家质量监督检验检疫总局.移液器检定规程：JJG 646—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.