陈文花（南昌市西湖区疾病预防控制中心,江西 南昌 330000）

丙肝是常见病毒性肝炎的一种，主要经过输血、针刺等渠道传播，呈现出全球性流行趋势，随着病情进展可能发展为肝细胞癌、肝硬化等，对人们的健康和安全造成严重威胁。丙肝抗体检测是目前诊断早期丙型肝炎病毒感染的主要手段，对于及早干预治疗丙型肝炎有重要意义。目前临床上主要选择ELISA方法进行测定，而很多医疗机构在实验中仍然使用手工加样方法处理。手工加样会影响加样量的标准性，加样量不规范可能对实验结果产生不良影响，影响检测结果的准确性[1]。因此需要重视加样量对检测结果的影响，从而加强对加样量的控制和校正，积极防范人为因素对检测结果的影响。本文于本中心2021年3月-2022年10月的血液样本中随机抽取5份展开研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2021年3月-2022年10月检测的不同浓度的血清样本中随机抽取5份作为样本，均使用北京万泰HCV-AB检测试剂盒。使用MK3酶标仪、finnpipette加样枪、水浴箱实验。

1.2 方法 在反应板上排板5×6共30孔，按照S/CO浓度从低向高进行编号，并添加100μL丙肝抗体稀释液。1排为1号标本，5孔分别取样6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。2排为2号标本，5孔分别取样6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。3排为3号标本，5孔分别取样6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。4排为4号标本，5孔分别取样6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。5排为5号标本，5孔分别取样6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。6排为对照组，5孔分别为空白对照、阴性、阳性、阳性、阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0软件处理本文数据，对符合正态分布的计量资料（±s）进行t检验，对计数资料（%）进行χ2检验，P＜0.05表示存在统计学意义。

2 结果

各组S/CO值结果：1号和5号样本随着加样量增加，S/CO值结果变化不大，即随着加样量增加，S/CO值变化不存在线性关系。2号、3号和4号样本随着加样量增加，S/CO值也呈现明显升高趋势，即随着样本加样量增加，S/CO值存在一定正相关关系。在3号样本中，加样量不足（≤8μL）时，S/CO值＜1，为阴性。当S/CO值在加样量＜6μL和＞14μL时，加样量变化对于S/CO结果无明显影响。详见表1。

表1 各组S/CO值结果

3 讨论

丙肝是由于丙型肝炎病毒（HCV）引起的病毒性感染，根据数据统计，全球发病率约为3%，每年新发患者达到3.5万例之多，是威胁人们健康的全球性流行疾病[2]。HCV感染后，通过免疫介导或者直接损伤，随着病程延长，患者可出现肝细胞坏死以及淋巴细胞浸润表现，形成纤维组织增生。患者患病后随着病程发展，可能会出现肝纤维化以及慢性炎症，部分患者可能发展为肝细胞癌以及肝硬化。近年来，丙肝患者死亡率持续升高，已经成为了威胁人们健康的公共卫生问题，受到全社会的关注。目前主要通过丙肝病毒抗体进行检查。及早筛查则能早期展开干预治疗，对于改善预后、规避不良结局有着重要意义。

HCV作为有包膜结构的病毒，其基因组由线性单股正链RNA构成，由于HCV复制主要受到RNA聚合酶所影响，但RNA聚合酶由于缺乏校正活性，极容易出现突变，形成免疫逃逸，基因组各个变异程度不同。感染HCV病毒后，人体免疫应答并不会立刻发生反应，因此急性感染症状轻微。一般在感染1周后会出现较高病毒滴度，但之后便会出现减缓，滴度峰值低于乙肝病毒感染[3]。在感染8-12周后，患者一般可以检测出HCV特异性抗体，病毒滴度降低。大部分患者感染后可能发展为慢性丙肝，病毒滴度相对稳定，只有少部分患者感染后可以恢复健康，在检测中无法检测出HCV RNA。即使已经经过治疗的HCV患者，其丙肝特异性抗体仍然无法消失，可能持续至10年以后。在临床检测中主要使用ELISA方法进行监测，其具有较高的敏感性，操作快速、简便，是免疫学检查中最常见的方法，目前乙肝五项、丙肝以及HIV等病毒抗体检测均通过ELISA方法进行实验。

ELISA检测方法能够利用包被抗原以及夹心抗原的方式进行检测，有效提高了检测特异性。该方法可以对IgG抗体进行检测，同时还可以检测IgM抗体，能够有效减少感染窗口期的影响，从而提高检测灵敏程度。首先，固相载体吸附抗原可以结合特异性抗体，在固相载体上发生抗体反应，可以检出特异性抗体。酶标抗原主要经过免疫反应以及化学反应让抗原和酶形成结合物。改良过碘酸钠法可以标记HRP（过氧化物酶），作为一种糖蛋白，过碘酸钠将无关多糖羟基进行氧化反应，形成醛基，醛基活性高，结合抗原游离氨基，可以得到HRP-CH2-NH-IgG[4]。抗体和酶发生结合反应后，添加硼氢化钠进行还原反应，可以得到酶标记物。该方法可以提高酶标记物的产率，是常见的标记抗体使用方法。戊二醛交联标记法是利用交联剂结合抗原和酶，抗原分子以及酶分子分别结合。两种标记方法都依赖于氨基、抗原分子和酶的结合。丙肝抗原的B细胞位点是HCV衣壳蛋白，属于强碱性蛋白，有着丰富的碱性氨基酸。如果直接标记抗原，将会造成位点抗原表位受到封闭，进而对检测敏感度产生影响。因此，ELISA检测方法重组连接硫氧还蛋白（TRX）以及HCV抗原，通过TRXmAb和桥蛋白TRX的反应，促进HCV抗原蛋白通过酶标记物形成复合物，可以对HCV抗原标记，进行检测。

目前ELISA方法作为丙肝病毒最常见的检测和诊断方法，也用于评估临床治疗效果，但ELISA检测结果受到实验操作的影响，其中加样量是影响检测结果的重要因素。加样量的多少会对检测结果产生直接影响，若减少加样量，可能出现假阴性结果，容易出现漏诊情况，影响患者的及时治疗，若加样量增加，则可能出现假阳性结果，可能造成临床误诊的情况，加样量多或少都会影响到最终检测结果。目前很多医疗机构仍然采取手工加样方式进行检测，人工目测和操作很难准确控制加样量，这也是影响检测结果的主要因素。因此，本文针对加样量变化对检测结果的影响展开研究，于我中心的采集样本中随机选取5份样本，分别添加不同剂量的样本量进行对比实验。经过本文统计，1号和5号样本随着加样量增加，S/CO值结果变化不大，即随着加样量增加，S/CO值变化不存在线性关系。2号、3号和4号样本随着加样量增加，S/CO值也呈现明显升高趋势，即随着样本加样量增加，S/CO值存在一定正相关关系。在3号样本中，加样量不足（≤8μL）时，S/CO值＜1，为阴性。当S/CO值在加样量＜6μL和＞14μL时，加样量变化对于S/CO结果无明显影响。证实当标本S/CO值在加样量＜6μL和＞14μL时，加样量变化并未对测定结果产生明显影响。但当标本S/CO值为0.3-7时，随着样本量增加，S/CO值也明显提高，受到加样量多少的影响，检测结果也存在一定偏差。因此，在ELISA实验过程中需要重视对加样枪校正控制，加强对加样量操作的管理，要求操作人员具备较高质量意识，能够严格控制加样量，以保证检测结果的准确性。

此外，在ELISA检测中，还需要注意以下几个方面。

①采集样本。一般情况下检验以血清为样本，采集血清样本要注意避免发生溶血反应，由于红细胞在溶解时可能会释放过氧化物酶，在ELISA测定中，溶血标本可能会异常显色，血清标本检测时如果受到污染，也可能会表现出假阳性反应。若血样标本存放时间过长，造成IgG聚合为多聚体，测定中则易造成假阳性反应。一般情况下，5d内采集的血样应保存于4℃环境下，若血样采集时间超过1周，则需要在低温环境下保存。②准备试剂。根据试剂盒说明，准备相关试剂。ELISA方法中主要使用去离子水或者蒸馏水，取出试剂后，放置在室温环境下备用，其余试剂均放置于冰箱中冷藏管理。③加样量。ELISA方法需要重复3次加样处理，包括添加标本、添加底物以及添加酶结合物。在加样过程中需要在板孔底部加样，避免在孔壁上加物，注意避免样本产生气泡或者溅出。使用微量加样器添加标本，按照实验规定量加样处理，每次添加标本都需要更换吸嘴，预防交叉污染的出现。稀释血清需要提前进行稀释，在试管内进行稀释后再加样。板孔应添加稀释液，再添加血清，使用振荡器进行震荡处理，确保充分混合。④保温。一般情况下包括两次抗体反应，添加标本以及添加酶结合物后出现，抗原抗体反应只存在于固相表面。抗体包被夹心方法将样本加入板孔之中，抗原没有同等机会结合固相抗体，贴近于孔壁位置的抗原可以和抗体结合，需要经过一段时间扩散反应后才能达到平衡。使用37℃水浴反应，将ELISA板放置于水浴箱中，让温度作用，使其达到快速平衡。为了避免受热蒸发，要使用封板条将反应孔封住处理。若使用保温箱设备，则将ELISA反应板放置于湿纱布之上，经过水浴或者湿盒温育，反应板都不能叠放，保证反应板温度可以达到平衡，并注意温育时间以及温度按照规定设计。⑤洗涤。ELISA方法通过洗涤作用促进酶标记物的分离以及结合，在洗涤处理后，将板孔中的残留清除掉，以吸附干扰物质，并在洗涤过程中将蛋白质吸附洗涤下来。洗涤在实验过程中十分关键，若洗涤操作质量不佳，也可能引起假阳性的问题。如血液凝固不全，存在纤维吸附的问题，洗板不充分，造成非固相酶残留，引起非特异性显色的问题，而显色过深可能会显示出假阳性的结果。在洗板后要注意观察板孔内是否存在残留问题，避免出现假阳性。使用的洗液均需要现配置，否则储存时间过长也容易引起混浊或者形成絮状物，容易出现堵孔的问题。按照说明书要求保证洗涤时间，并根据实际情况适当增加洗涤时间，可以避免假阳性的问题。⑥比色。显色后需要在规定时间内进行比色，以酶标仪测定结果，不能根据目测结果判定。并注意观察各孔比色液体积是否一致，否则可能产生误差。如果比色液体积过少，液面低可能和孔内壁形成折光，造成吸光度的提高。因此测定过程中还需要关注显色剂的添加剂量。

因此，在ELISA检测过程中需要严格控制操作质量，按照说明书要求进行操作，才能保证检测结果的真实准确，对丙肝检测结果负责，降低假阳性率。

综上所述，为了保证ELISA方法测定丙肝抗体检测结果的准确性，在实验过程中要严格遵守技术要求，使用稳定试剂以及先进设备，更需要保证加样量的准确值，严格按照规范操作进行加样处理，避免假阳性以及假阴性的结果。