日粮酪氨酸水平对固原乌鸡黑色素生成的影响

2023-09-13叶宇恒高思语张珠明赵晶晶周欣悦

现代畜牧兽医 2023年8期

叶宇恒，高思语，张珠明，王华，赵晶晶，周欣悦，张莉

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021 ）

固原鸡又称静原鸡、朝那鸡，原产自宁夏回族自治区固原市彭阳县，是宁夏唯一的地方优良肉蛋兼用鸡种[1]。固原乌鸡属于固原鸡的分支，不但肉质细嫩、味道鲜美，还富含黑色素，具有很高的营养和保健价值。乌骨鸡作为补品时的滋补效果由其体内黑色素的含量决定，这是由于黑色素能够在动物体内发挥很多重要作用，如抗菌、抗病毒、清除自由基、提高皮肤抗辐射能力[2]等。乌骨鸡体内的黑色素被认为是其发挥药效作用的物质基础，故提高乌骨鸡体内黑色素含量成为提高其药用价值的重要措施[3]。

黑色素由酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下经过一系列的生化反应生成[4]。研究表明，日粮中添加适量酪氨酸可提高乌鸡体内黑色素含量，提高营养价值[5]。但有关酪氨酸在固原乌鸡生产中的应用报道较少，基于此，本试验采用不同酪氨酸水平的日粮饲喂固原乌鸡，观察日粮中不同酪氨酸水平对4～12周龄固原乌鸡组织与血清中酪氨酸酶活性及组织中黑色素含量的影响，为利用营养调控手段提高固原乌鸡营养价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

试验动物为固原乌鸡，由宁夏固原市彭阳县益斌园农畜综合开发有限公司提供。试验采用单因素试验设计方法，选用体况良好、体重相近的4周龄固原乌鸡150只（公、母各半），随机分成5组，每组3个重复，每个重复10只鸡。对照组试验鸡饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的L-酪氨酸（河北华阳生物科技有限公司，纯度为99.9%）。试验期8周。基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平Tab.1 Basic diet composition and nutrient level

试验固原乌鸡均在同一鸡舍内，采用3 层阶梯式鸡笼饲养，独立乳头式饮水器，自由采食和饮水。试验开始前对笼舍进行全面消毒，保持舍内温度为18～20 ℃，湿度为50%～60%，光照时间为20 h 减少至自然光照（每周减少2 h）。每日打扫鸡舍卫生并定期消毒，并依照常规免疫程序进行免疫。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 样品采集

试验鸡12周龄末禁食12 h，处死后翅静脉采血5 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清，分组标记后放入-20 ℃冰箱冷冻保存。

取5组试验鸡肝脏、腹部皮肤、气管、肺脏与回肠的小块组织，生理盐水清洗后采用10%甲醛中性缓冲液4 ℃固定组织。同时取5组试验鸡肝脏、腹部皮肤、回肠与胸肌组织样品5 g 左右放入冻存管中，液氮保存，后续转移到-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 组织黑色素颗粒分布

采用苏木精-伊红（HE）染色法，用自来水冲洗固定后的组织小块，上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，石蜡切片（5 µm）。切片二甲苯脱蜡，复水，盐酸酒精分化，HE 染色，酒精脱水，透明，中性树胶封片，使用BM2000光学显微镜观察400倍视野中的黑色素颗粒分布情况，记录单个视野中黑色素颗粒含量。

1.2.3 血清与组织中酪氨酸酶活性

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，通过抗原抗体特异性结合、底物显色，使用酶标仪（BIO-Tek）测得450 nm波长下的吸光度值，制作标准曲线，计算样品浓度。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2.4 组织中黑色素含量

测定方法同1.2.3。

1.2.5 血清促黑素细胞激素（α-MSH）活性

测定方法同1.2.3。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用Excel 软件进行初步处理，SPSS Statistics 22 统计软件中的ANOVA 过程进行单因素方差分析，Duncan's 法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织黑色素颗粒分布与含量的影响

2.1.1 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织黑色素分布的影响（见图1～图5）

图1 黑色素在固原乌鸡肺脏中的分布情况Fig.1 Distribution of melanin in lung of Guyuan black-bone chickens

图2 黑色素在固原乌鸡气管中的分布情况Fig.2 Distribution of melanin in trachea of Guyuan black-bone chickens

图3 黑色素在固原乌鸡腹部皮肤中的分布情况Fig.3 Distribution of melanin in abdominal skin of Guyuan black-bone chickens

图4 黑色素在固原乌鸡回肠中的分布情况Fig.4 Distribution of melanin in ileum of Guyuan black-bone chickens

组织切片观察结果显示，5 组乌鸡组织的黑色素分布情况一致。

由图1～图5可知，对照组和0.8%酪氨酸组固原乌鸡的肺脏内黑色素分布广泛，主要见于小叶间、各级支气管管壁和支气管管间结缔组织。气管内黑色素分布连续且密集，呈链状或线状，主要存在于外膜或黏膜下层中。腹部皮肤中表皮基底层有大量黑色素细胞存在，黑色素主要存在于毛囊周围和真皮中的胶原纤维与弹力纤维之间。回肠内黑色素主要分布于肌层与浆膜之间、少量存在于肌层和浆膜中。肝脏中未发现黑色素颗粒。

2.1.2 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织中黑色素颗粒含量的影响（见表2）

表2 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织中黑色素颗粒含量的影响Tab.2 Effect of dietary tyrosine level on the content of melanin particles in tissues of Guyuan black-bone chickens

由表2 可知，与对照组相比，0.8%酪氨酸组固原乌鸡的肺脏、气管、腹部皮肤与回肠等组织中黑色素颗粒含量均有不同程度的增加。各组固原乌鸡肝脏中均未观察到黑色素颗粒。

2.2 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡血清与组织中酪氨酸酶活性的影响（见表3）

表3 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡血清与组织中酪氨酸酶活性的影响Tab.3 Effect of dietary tyrosine level on tyrosinase activity in serum and tissue of Guyuan black-bone chickens

由表3 可知，与对照组相比，日粮酪氨酸添加水平为0.4%时，固原乌鸡腹部皮肤、胸肌、回肠中酪氨酸酶的活性显著提高（P＜0.05）；日粮酪氨酸添加水平为0.6%、0.8%时，固原乌鸡腹部皮肤、胸肌、回肠、肝脏与血清中酪氨酸酶的活性均显著提高（P＜0.05）。

当日粮酪氨酸添加水平为0.2%时，固原乌鸡腹部皮肤、胸肌、回肠、肝脏与血清中酪氨酸酶的活性与对照组相比差异均不显著（P＞0.05）。

2.3 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织中黑色素含量的影响（见表4）

表4 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织中黑色素含量的影响Tab.4 Effect of dietary tyrosine level on content of melanin in tissues of Guyuan black-bone chickens单位：ng/g

由表4 可知，与对照组相比，日粮酪氨酸添加水平为0.2% 时，固原乌鸡胸肌中黑色素的含量显著提高（P＜0.05）；日粮酪氨酸添加水平为0.4%～0.8%时，固原乌鸡腹部皮肤、肝脏、胸肌、回肠中黑色素的含量均显著提高（P＜0.05）。0.8%酪氨酸组固原乌鸡腹部皮肤、肝脏及胸肌中黑色素含量均显著高于0.4%酪氨酸组、0.6%酪氨酸组（P＜0.05）。

2.4 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡血清α-MSH 活性的影响（见表5）

表5 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡血清α-MSH活性的影响Tab.5 Effect of dietary tyrosine level on activity of serum α-MSH in Guyuan black-bone chickens单位：μg/L

由表5 可知，与对照组相比，日粮酪氨酸添加水平为0.4%～0.8%时，固原乌鸡血清α-MSH 活性均显著提高（P＜0.05），且0.8% 酪氨酸组高于0.4% 酪氨酸组和0.6%酪氨酸组（P＜0.05）。0.2%酪氨酸组固原乌鸡血清α-MSH活性与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织中黑色素颗粒分布及含量的影响

黑色素（melanin）一词最早是在1840年由Berzelius 提出，当时泛指黑色动物的色素[6]。根据黑色素的功能与来源可将其分为真黑素（eumelanin）、褐黑素（pheomelanin）、神经黑色素（neuromelanin）、脓黑色素（pyomelanin）[6-7]。禽类的羽毛以及皮肤颜色均由黑色素决定，过多的黑色素沉积会导致皮肤、肌肉甚至内脏均呈现黑色性状，便形成了乌鸡这一品种[8]。Nganvongpanit等[9]对泰国乌骨鸡的33个器官黑色素沉着分布进行研究发现，肝脏是唯一没有黑色素沉着的器官。大多数器官的所有组织层中均存在黑色素，但一些器官只有特定层中存在。郭慧[10]在对泰和乌骨鸡的研究中也证明了这一点，肝脏中内仅有浆膜表面附着一些黑色素，乌鸡黑色素沉积分布机制有待进一步研究论证。曹艳芳等[11]研究发现，日粮酪氨酸水平在0.2%～0.8%时，淅川乌骨鸡皮肤的乌度随酪氨酸水平的提高而变深。固原乌鸡组织中黑色素分布情况与其他乌鸡类似，除肝脏外均有黑色素颗粒存在，而日粮中添加酪氨酸能够不同程度地增加黑色素颗粒含量。

3.2 日粮酪氨酸水平对血清与组织中酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸是一种结构复杂的含铜离子氧化还原酶[12]，在黑色素合成过程中，酪氨酸基因家族级联调控决定了黑色素的生成[13]。酪氨酸是黑色素生化合成过程中的限速酶，当酪氨酸活性升高时有助于机体合成黑色素。Solminski等[14]对黑色素细胞进行培养试验，结果表明，酪氨酸不仅是黑色素的前体，同时还可提高酪氨酸酶的活性。赵艳平等[15]在对3 个生长阶段的泰和乌鸡研究中发现，在日粮中分别添加1.18%、0.88%和1.25%水平的酪氨酸均能够有效提高乌骨鸡血清中酪氨酸酶的活性。杨杰等[16]研究发现，随着饲料中酪氨酸含量增加，红罗非鱼皮肤与血清中酪氨酸酶的活性也会增加。张倩雲等[17]研究发现，添加酪氨酸能够显著提高13～20周龄凌云乌鸡血清与皮肤中酪氨酸的活性。王鑫磊[18]研究表明，日粮中添加的酪氨酸越多，豫粉1号蛋鸡血清中的酪氨酸酶活性越高。本试验结果与前人研究结论相似，表明日粮中添加0.4%～0.8%的酪氨酸能够有效提高固原乌鸡血清与组织中酪氨酸酶的活性。

3.3 日粮酪氨酸水平对固原乌鸡组织中黑色素含量的影响

乌鸡黑色素具有抗氧化应激、预防癌变、排铅解毒、提高机体免疫力和保护神经系统等多种生物学功能[19]。与普通肉鸡相比，乌骨鸡各组织中存在大量的黑色素，其作为补品的滋补效果与黑色素含量呈正相关，即黑色素含量越高，药用效果越佳[20]。黑色素生成的原料是酪氨酸，因此在生长过程中，日粮酪氨酸的含量应满足乌骨鸡的需求。王杰[21]对淅川乌骨鸡的研究表明，日粮中添加0.4%～1.0%的酪氨酸能够显著提高胸肌中黑色素含量。黎观红等[22]研究发现，日粮中酪氨酸添加量为0.4%～0.7%时可以提高泰和乌骨鸡胸肌、腿肌、皮肤组织中黑色素的含量。据Wang等[23]报道，提高饲料中酪氨酸含量，罗非鱼皮肤中的黑色素含量会相应提高。本研究中虽然未在肝脏中观察到真黑素，但试验结果表明在固原乌鸡肝脏中也存在一定量的黑色素，或是其他种类的黑色素。本试验结果表明，日粮添加0.4%～0.8%酪氨酸能够显著提高固原乌鸡组织中黑色素的含量，且以添加水平为0.8%时效果最好。

3.4 日粮酪氨酸水平对血清中α-MSH活性的影响

α-MSH是一种神经内分泌激素，由13个氨基酸构成，源自其前体激素阿黑皮素原[24]。研究发现，α-MSH 在黑色素生成过程中起到重要的调节作用，可以维持和调节黑色素细胞增殖和树突形成[25]；而且α-MSH 与黑素皮质素受体1结合后可激活腺苷酸环化酶，从而提高细胞内环磷酸腺苷水平及酪氨酸酶的合成及表达，促进黑色素合成[26]。熊渺等[27]研究表明，α-MSH 能够促进黑色素细胞增殖并增加细胞内黑色素含量。许冬梅等[28]研究表明，α-MSH 可促进黑色素相关基因和蛋白的表达。郝晓娟等[29]报道指出，不同浓度α-MSH 可通过调控黑色素形成中的环磷酸腺苷通路相关基因和蛋白的表达，从而影响黑色素生成，且以添加10 nmol/L α-MSH时效果最显著。本试验结果表明，外源性添加酪氨酸可增加固原乌鸡血清中α-MSH的活性，提高黑色素含量。