袁 红，舒相华，姚 俊，张 莹，罗班乾，李 鲜，王凤刘，宋春莲*

（ 1. 云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201 ；2. 云南省畜牧兽医研究所，云南 昆明 650212 ； 3. 云南省永德县畜牧兽医局，云南 临沧 677600 ； 4. 云南省宾川县动物疫病预防控制中心，云南 大理 671600 ）

在猪养殖过程中，猪的相关腹泻病毒和致病性细菌严重制约了猪群健康生长，主要表现为腹泻、呕吐、脱水、消瘦，各年龄段猪群均易发病，发病率和死亡率可高达100%，给养猪业带来巨大的经济损失[1-2]。猪场常见的腹泻病毒有猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV），引起肠道腹泻的细菌有大肠杆菌、魏氏梭菌、猪痢疾杆菌、猪沙门氏菌等[3]。由于PEDV、TGEV、PoRV 和细菌引起的腹泻，临床特征往往相似，难以鉴别区分，且常有混合感染的情况发生[4-5]，提高了疾病发生的严重性与复杂性。因此，临床中需要借助实验室检查手段进行检测与鉴别诊断。

如今，国内外很多学者已经建立了肠道腹泻病毒的多重RT-PCR 鉴别诊断方法。Salem 等[6]建立了TGEV 和PEDV 双重RT-PCR 检测方法。范皓天[7]建立了PEDV、TGEV、PoRV 三重RT-PCR 的检测方法。丁庆文等[8]建立了PDCoV、PEDV、猪萨佩洛病毒（PSV）三重RT-PCR的检测方法。王睿敏[9]和周亭宇[10]建立了PEDV、TGEV、PoRV、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）四重RT-PCR 检测方法。Liu等[11]建立了PEDV、TGEV、轮状病毒（RVA）、猪圆环病毒-2（PCV2）和猪圆环病毒-3（PCV3）五重RT-PCR检测方法。丁光明[12]建立PEDV、TGEV、猪轮状病毒-A（PRV-A）、PDCoV、猪嵴病毒（PKV）和猪札幌病毒（PSaV）六重RT-PCR的检测方法，但迄今尚无PCR可同时检测并区分是病毒或细菌引起腹泻的报道。本研究对PEDV、TGEV、PoRV 基因组保守区域设计特异性引物，结合细菌16s rRNA通用引物，通过各种优化反应条件成功建立了可同时检测病毒和细菌的多重PCR检测方法，并将建立的多重PCR检测方法应用于临床检测，以期为病毒与细菌的快速诊断和流行病学调查提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病毒株与细菌

PEDV、TGEV、PoRV 三联活疫苗购自哈尔滨维科生物技术有限公司；大肠杆菌标准株、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）、PRV、猪细小病毒（PPV）、PCV-2核酸由云南省高校畜禽重要疾病防控重点实验室保存。

1.1.2 病料

病料来自四川凉山彝族自治州某猪场，共2 份7 日龄哺乳仔猪小肠、9份母猪粪便。

1.1.3 主要试剂

病毒RNA 和DNA 试剂盒、反转录试剂、E. coliDH 5a感受态细胞、pMD18-T载体、2×Taq PCR Mas-ter MIX 试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 主要仪器

离心机（艾本德股份公司）；PCR 扩增仪、凝胶成像分析仪器（美国伯乐公司）；电泳仪（北京六一仪器厂公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成

引物设计的参照毒株均为来自GenBank 上的基因核酸序列，PEDV-N基因序列（登录号：AF353511）、TGEV-S基因序列（登录号：AJ271965.2）、PoRV-VP6（登录号：FJ617209）、细菌16s rRNA通用引物。使用Oligo 7软件分别设计应用于扩增PEDV、TGEV、PoRV 和目的基因片段的特异性引物，并由上海生工生物工程有限公司进行合成，引物信息见表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.2.2 重组质粒标准品的构建

1.2.2.1 RNA和DNA的提取

按照Takara 试剂盒9766 进行病毒RNA 提取，大肠杆菌用Takara试剂盒9763进行细菌DNA提取，-80 ℃保存。

1.2.2.2 RNA反转录及PCR的扩增

参照Takara试剂盒RR047A，进行RNA反转录。

PCR 扩增体系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、特异性引物或细菌通用引物上下游各1 μL、反转录产物或DNA各1 μL、灭菌双蒸水9.5 μL补足反应体系。

PEDV-N-901 PCR扩增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。TGEV-S-571 PCR 扩增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。

PoRV-VP6-257 PCR 扩增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。 16S rRNA-1500 PCR 扩增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 个循环；72 ℃10 min，4 ℃延伸。

1.2.2.3 目的基因的纯化

将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。在紫外灯下显示出目的条带并进行切割，装至1.5 mL EP管中称重。按照天根胶回收试剂盒进行DNA纯化。

1.2.2.4 目的基因的克隆与转化

在界定“整本书阅读”这一概念时，不少学者用结构主义二元对立的方法来阐释，从与“篇章阅读”相对立的角度，认为“整本书阅读”首先在阅读材料上不再是一篇节选文章的含英咀华，而是一本有着独立精神、独特思想价值，能够作为一个连续性整体给读者别样阅读感受的完满集合，阅读材料更长，也更具复杂性，完成这一复杂阅读任务的时间更长，表现出来的阅读行为也更具连续性。其次，不同于“列书单式”阅读时代，仅仅是“读”的粗浅要求，整本书阅读是以“读透”，读出长进为硬性指标的深层次阅读。在整本书阅读课上，教师是引导者、倾听者，更多的时候是调控者、记录者。整本书阅读教学策略是在师生共同阅读中生成的。

取纯化后的DNA产物，连接至pMD18-T载体上。转化DH5a 感受态细胞，挑选白色单个菌落进行菌液扩增。扩增后的菌液，取少量直接进行扩增，阳性菌液送至上海生工公司进行测序鉴定，其中部分菌液放置-80 ℃保存，以便后续使用。

1.2.2.5 重组质粒的制备

将PCR、测序鉴定均为阳性的样品，根据天根质粒抽提试剂盒进行重组质粒的制备。

1.2.3 多重PCR反应条件的优化

将已构建的4 种重组质粒标准品作为该试验模板，建立总体积为25 μL 的多重PCR，反应扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、4对引物上下游各0.5 μL、4种质粒各0.7 μL、无酶水5.7 μL。将PCR的退火温度分别设置为45.0、46.0、48.0、50.0、51.0、53.5、55.0、57.0 ℃，上下游引物浓度分别为10.000 00、7.500 00、5.000 00、2.500 00、1.250 00、0.625 00、0.312 50、0.156 25 μmol/L，循环次数分别为20、25、30、35、40、45个循环，最后选择最佳退火温度、上下游引物浓度、循环次数。

1.2.4 多重PCR的特异性、敏感性、重复性试验

本试验分别以PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRRSV的cDNA 和细菌、PCV-2、PRV、PPV 的DNA 为模板，无酶水为阴性对照，检测试验所构建的多重PCR方法的特异性。

将4 种重组质粒先单项进行敏感性试验，选定各浓度相等进行，再将4 种质粒等比例混合，均以10 的倍比系列稀释为浓度1.72×109～1.72×10 copies/μL 的混合液，进行多重PCR的敏感性试验，随机选取多重PCR同一个浓度进行多次重复性试验。

1.2.5 临床样品的检测

对四川省凉山彝族自治州某猪场发生腹泻的母猪和哺乳仔猪进行检测，共采集11份样品，其中哺乳仔猪小肠2份，母猪粪便9份。

2 结果与分析

2.1 四重PCR方法的建立

2.1.1 多重PCR退火温度的优化（见图1）

图1 多重PCR退火温度的优化Fig.1 Optimization of the multiplex PCR annealing temperature

由图1 可知，各个反应体系在不同退火温度下均可扩增出较为清晰的条带，但退火温度过高或过低均会影响后期试验。再根据每对引物的熔解温度（Tm值），因此，本试验中选取53.5 ℃为最适退火温度。

2.1.2 多重PCR引物浓度的优化（见图2）

图2 多重PCR引物浓度的优化Fig.2 Optimization of multiplex PCR primer concentrations

由图2 可知，经过优化，PEDV-N引物浓度为1.250 00 μmol/L、TGEV-S引物浓度为2.500 00 μmol/L、PoRV-VP6 和16s rRNA 引物浓度为5.000 00 μmol/L 时条带最清晰明亮。

2.1.3 多重PCR循环次数的优化（见图3）

由图3 可知，当循环次数为35 次时，扩增条带最清晰明亮，确定为该体系的最佳循环次数。

注 ： M为DL2000 DNA Marker；1～6分别为循环次数20、25、30、35、40、45。

2.1.4 多重PCR反应条件的确定

该体系经优化反应条件，确定多重PCR 的反应体系（共25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL；PEDV-N上下游引物（10 μmol/L）1.250 00 μmol/L、TGEV-S上下游引物（10 μmol/L）2.500 00 μmol/L、16s rRNA 和PoRV-VP6 上下游引物（10 mol/L）5.000 00 μmol/L；模板2.8 μL、灭菌双蒸水5.7 μL。

多重PCR 扩增程序：94 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，53.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。

2.1.5 多重PCR特异性试验（见图4）

图4 多重PCR特异性试验Fig.4 Multiplex PCR-specific test

由图4 可知，只有PEDV、TGEV、PoRV 和细菌扩增出相应的目的片段，而PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 均未出现扩增条带，表明多重PCR无交叉反应。

2.1.6 多重PCR敏感性试验（见图5）

图5 多重PCR敏感性试验Fig.5 Multiplex PCR sensitivity test

由图5可知，PEDV、TGEV、PoRV、细菌的检出下限均为1.72×103copies/μL。

2.1.7 多重PCR重复性试验（见图6）

图6 多重PCR重复性试验Fig.6 Multiplex PCR reproducibility test

由图6可知，选取浓度为1.72×105copies/μL进行6次重复性试验，结果均可扩增出一致的目的条带，表明建立的方法具有良好的重复性。

2.2 多重PCR方法的临床初步应用结果（见图7）

图7 临床样品检测结果Fig.7 Test results of clinical samples

由图7可知，11份腹泻样品均呈PEDV阳性，并且部分母猪有细菌混合感染。将其纯化后进行测序，测序结果在NCBI进行比对，证实了仔猪和母猪均被PEDV所感染，其中4头母猪有细菌混合感染，细菌为恶臭假单胞菌。

3 讨论

目前，由PEDV、TGEV、PoRV和细菌性引起的腹泻临床中多以呕吐、腹泻、厌食和脱水为主要症状，通过临床症状和病理解剖难以区分鉴别[13-15]，必须借助实验室检测进行诊断。本文针对PEDV、TGEV、PoRV设计3对特异性引物，结合细菌16S rRNA 通用引物设计猪腹泻性病毒和细菌的多重PCR方法，以三联苗和大肠杆菌标准株为阳性对照进行重组质粒标准品的构建；以标准品为模板，进行多重PCR条件的优化，阳性对照扩增可得到257、571、901和1 500 bp 的特异性条带，表明成功建立起多重PCR。灵敏度试验结果表明，该方法灵敏度可达1.72×103copies/μL；在重复6次后，重复性好，并成功应用于临床检测。结果表明，试验所建立的方法灵敏度高、重复性好、特异性高。对四川省凉山州红岩子某规模化猪场11份哺乳仔猪和母猪腹泻样品进行检测，得到和阳性对照相同大小的目的片段，将其纯化后测序，所得序列在NCBI 上进行比对，比对结果为哺乳仔猪和母猪被PEDV和恶臭假单胞菌感染，为病毒和细菌混合感染。

临床中由细菌和病毒引起的腹泻很常见。刘磊等[16]对某规模化猪场内出现腹泻情况的仔猪进行检测，结果显示，PEDV 和猪链球菌混合感染是引起该场猪发病的主要原因。黄美州[17]对甘豫地区仔猪泄泻病致病细菌和病毒进行研究，结果发现，致病性大肠埃希氏菌和PEDV 是主要导致猪腹泻的主要病原。上述研究结果表明，猪腹泻往往由病毒和细菌混合感染所致。但细菌和病毒引起的腹泻目前无法通过同一诊断技术PCR进行鉴别，本试验为区别猪腹泻是由病毒或细菌感染提供了一种新的临床鉴别诊断方法，在一定程度上提高了诊断的效率，节约了时间与经济成本，进而为临床鉴别诊断猪腹泻的病因是细菌或病毒感染提供一定的诊断价值。

4 结论

本试验所建立的猪腹泻性细菌和病毒多重PCR 方法能够在第一时间鉴别诊断出猪腹泻的病因是细菌或病毒感染，为临床诊疗节约了时间与成本。