赵振阳，许晓玲，白佳桦，肖霖力，秦玉圣，刘 彦，杨 凌

（1.河北工程大学，河北邯郸 056000；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097）

家畜胚胎移植技术（Embryo transfer，ET）是指将家畜的受精卵或早期胚胎取出移植到同种动物的另一母体内，使之继续发育为胎儿的技术。该技术有助于缩短世代间隔，可高速、有效地深挖与扩散优良个体的优秀基因，从而促使优秀个体被最大程度地扩繁和利用。牛胚胎移植技术经过数十载的发展，日渐成熟，被广泛的应用在了实际的繁殖生产，成为新品种培育和良种快速扩繁的重要技术手段[1-4]。牛胎移植技术是一个从供体牛经超排处理后收集胚胎，移植到相同生理状态下受体牛子宫，最后到完成受孕产犊的过程，包含供体牛超排处理、人工授精、胚胎的回收和受体选择、同期处理和胚胎移植。胚胎移植过程中最关键的问题就是，供体牛体内产生多个成熟的卵泡，而不是正常的只去产生一个，体内产生的胚胎最终可以转移到受体牛体内进行妊娠。为了获得大量可转移的胚胎，超数排卵的步骤则是至关重要的。

目前，在牛胚胎移植中，胚胎主要来自超数排卵后第7 天非手术法获取的供体母牛[5]。尽管科研人员已对牛超排方案进行了深入研究，但是自牛胚胎移植技术成功以来，每次超排处理后，回收的平均可用胚胎数并不高，约1/3 的供体母牛存在较差的超排反应，并且相同的方案处理不同的个体效果差异显著[6,7]。实际生产中，约64%的供体生产的可用胚数达不到平均水平[8]，甚至有15%左右的供体不能生产出可用胚胎[9]。超排反应的不确定性提高了牛体内胚胎生产的成本，限制了该技术在生产中的应用效率。因此，本文就牛卵泡发育规律、超排所用激素种类、经典的超排处理方案和效果，以及影响因素等进行简单叙述，以期为牛体内胚胎高效生产提供技术支持。

1 卵泡发育

1.1 发情周期卵泡发育

在下丘脑-垂体-卵巢轴相关联的激素作用下，卵巢卵泡和黄体交替发育。促卵泡素（Follicle-stimulating hormon，FSH）会促进小有腔卵泡的生长和发育，在促黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）的刺激下，1～2 个优势卵泡会形成并排卵。此后，颗粒细胞和内膜细胞等形成黄体，分泌孕酮（Progestational，P4）。牛是单胎动物，所以通常情况下发情时只有一个卵泡发育可以形成优势卵泡。但事实上，大于95%的母牛在一个发情周期有2～3 个卵泡波[10]。自然状态下，大概有70%的母牛在一个发情周期中有两个卵泡波，分别从发情周期第2 天和第9～10 天开始；大约有30%的母牛在一个发情周期有3 个卵泡波，分别从发情周期第2、8～9 和15～16 天开始[11]。不过，无论母牛发情期中有几个卵泡波，只有在母牛发情时的卵泡波才会形成优势卵泡并排卵，其他的都会在不同阶段闭锁、退化[12]。

1.2 卵泡发育的激素调节

原始卵泡库中的腔前卵泡是通过自分泌和旁分泌调节进行募集和发育成有腔卵泡的，促性腺激素影响腔前卵泡的发育速度。进入卵泡发育库后在促性腺激素作用下发育成小的有腔卵泡[13]，当卵泡大于4mm 以后，它就完全依赖促性腺激素进行后期发育了。有腔卵泡在FSH 的作用下继续发育形成优势卵泡，2～3d 后发育为排卵卵泡，并在LH 脉冲式分泌的条件下排卵。当卵泡直径发育到大于8mm 时，雌激素(Estrogen，E2）的合成与分泌激增，增强了该卵泡对促性腺激素和营养物质的摄取能力，从而抑制其他卵泡发育。

排卵后，卵泡内颗粒细胞和内膜细胞受到LH 刺激发生黄体化，开始泌P4。此时，P4负反馈机制阻碍了下丘脑促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）和垂体FSH、LH 的合成与分泌。如果母牛发情后未进行参配或者配种后没有受孕，在情期的第16 天左右，子宫将会合成和分泌前列腺素（Prostaglandin，PG），溶解黄体细胞。此时，血液中P4水平下降，其对下丘脑GnRH 和垂体FSH、LH 的合成和分泌的抑制作用解除，下一波卵泡发育开始，母牛进入下一个发情周期[14]。

2 超数排卵

超数排卵是指在雌性动物正常的发情周期中，通过使用外源促性腺激素诱导卵巢内较多的卵泡发育并排卵的技术。20 世纪50 年代后期至60 年代初期，美国农业部、康奈尔大学和威斯康星大学等机构就开始了牛羊超数排卵的研究，当时使用的激素是马绒毛膜促性腺激素（Equine chorionic gonadotropin，eCG），也就是妊娠母马的血清促性腺激素（PMSG）[15]。随后几十年，研究人员开始探寻超数排卵的激素方案。诱导超数排卵的激素种类很多，最常用的是各种家畜的垂体提取物（FSH，LH），马绒毛膜促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，HCG）。超数排卵的有效性取决于所使用的促性腺激素的类型、给药期、总剂量以及多次给药时它的减少程度。

2.1 牛超排中常用的生殖激素

2.1.1 促卵泡素

促卵泡素是由动物垂体前叶细胞分泌的糖蛋白激素，其分子是由非共价键结合的α 和β 两个亚基组成的异质二聚体。FSH 的主要作用包括刺激卵泡的生长发育，卵泡颗粒细胞E2合成和分泌以及LH 受体的表达，刺激卵泡膜细胞上LH 受体产生。研究表明，不同动物体FSH 的半衰期并不相同[16]。FSH 超排处理供体牛的效果相对其他激素更加稳定，因此，目前世界上牛胚胎移植的生产实践中更多的使用FSH 去处理供体牛生产胚胎。由于FSH 在供体牛体内的半衰期仅有5h 左右，所以，在超排程序中必须连续注射，每天2次，持续4d，以确保供体牛血液中FSH 浓度保持稳定，维持正常的超数排卵所需的水平。

2.1.2 促黄体生成素

促黄体生成素是由动物垂体前叶细胞分泌的糖蛋白激素，在公畜体内又称促间质细胞素（ICSH），由α 和β 两个亚基组成。LH 与FSH α 亚基的相对分子质量相等，并且两者可以相互交换，所以一般认为LH 和FSH 的作用与β 亚基有关。LH 与FSH 共同促进卵泡的生长发育、成熟，同时促进卵泡内膜雌激素分泌。在排卵过程中，LH 起主导作用，并促使卵泡破裂后，黄体的形成和孕酮分泌。除此之外，LH 还能促进睾丸间质细胞的成熟和睾酮分泌，以及精子成熟。在现有的商品FSH 中，通常都会添加一定比例的LH，FSH 和LH 两者配伍使用效果更好。

2.1.3 促性腺激素释放激素

促性腺激素释放激素是一种由下丘脑合成和分泌的激素，其主要作用是促进垂体前叶LH 和FSH 的合成与分泌。有研究指出，GnRH 能够诱导卵泡发育和排卵。处理1.5～2d 后，将会出现一个新的卵泡波。只有卵泡波存在时，GnRH 才会诱导排卵[17]。在发情周期的任意时间使用GnRH，可以使44%～55%的奶牛[18]和60%的肉母牛排卵[18]。

2.1.4 孕酮

孕酮是一种类固醇激素，主要来源于卵巢的黄体细胞。此外，肾上腺、卵泡颗粒细胞和胎盘也分泌孕酮。睾丸也分泌少量的孕酮，主要是雄激素合成过程的中间产物。在妊娠期间，P4扮演着非常重要的角色。它作用于子宫黏膜，促进并维持其增长以及刺激子宫腺的增长和分泌功能，这为后期胚胎的着床和发育创造了必要的条件。此外，P4还可以促进子宫颈收缩、削弱子宫肌肉的蠕动和降低孕期子宫的兴奋性，从而维持妊娠。在实际应用中，P4主要被制成孕激素阴道海绵栓或孕激素阴道Y 型栓这两种产品。这些产品被广泛应用于动物生产中，以帮助维持妊娠和促进动物的繁殖。

2.1.5 前列腺素

前列腺素是一类存在于动物和人体中的不饱和脂肪酸组成的、具有多种生理作用的活性物质，目前已发现的种类有几十种。精囊腺是PG产生最多的一个部位，其次是肾髓质、肺和胃肠道。此外，脑、肾上腺、脂肪组织等也合成比较多的PG。PG 还存在于卵巢、子宫内膜、胎盘以及精液、睾丸等。PG 的作用广泛，在不同组织中即使是同种PG 也有不同功能。PGF 对黄体有明显的溶解作用，PGE1可以抑制排卵，PGE2α则可以使血液中的LH 水平上升从而促进排卵；PGE1和PGE2都可以促进垂体LH 和FSH 的释放，但是PGE2的作用更大。除此之外，某些PG还能刺激子宫平滑肌收缩、促进胎盘和恶露排出的作用。

2.1.6 马属动物绒毛膜促性腺激素

马属动物绒毛膜促性腺激素，最早是从妊娠母马血液中获得的一种糖蛋白质激素，因此也叫孕马血清促性腺激素。eCG 是由妊娠40～150d的马属动物子宫内膜杯组织细胞合成并分泌，它由α 和β 亚基组成，兼备了FSH 和LH 共同的生理功能。研究者们将eCG 应用到了牛超数排卵上，通过注射eCG，可以增加牛体内FSH 和LH的水平，促进卵泡发育和成熟，同时也增加黄体体积和孕酮的分泌，为妊娠创造了更好的环境。除了对牛的繁殖有帮助外，eCG 还被广泛应用于其他动物的繁殖中，例如羊、猪、驴、兔等。

2.2 经典的牛超排方案

2.2.1 CIDR+FSH+PG

⑴对和牛的处理情况和效果

在89 头供体和牛发情周期上的任意一天早上埋植CIDR（第0 天），第5 天开始FSH（Folltropin-V，400mg NIH/ 瓶，20mL 生理盐水稀释）处理。FSH 连续处理4d，分为每天早上8:00，晚上20:00 2 次，每天递减（2、1.5、1、0.5mL）肌肉注射的方法。第7 天打FSH 同时肌注0.6mg PG，在第二次打完PG 后撤栓。第9 天观察发情，发情12h 后输精，间隔12h 再次输精。每次输1 支冻精，输到子宫体前端，最后一次输精后第7 天采用非手术法冲胚。结果显示：该处理超排有效率为85.4%，平均回收胚胎数12.0 枚，平均可用胚胎数8.7 枚[19]。

⑵对雷琼牛的处理情况和效果

在10 头雷琼牛供体牛发情周期上的任意一天早上埋植CIDR（第0 天），第9 天开始FSH 处理。采用4 天8 次(早上7:00，晚上19:00)递减肌肉注射FSH（4、3、2 和1 AU）的方法处理。在第11 天上午注射FSH 同时肌肉注射0.6mg PG，第12 天上午注射FSH 同时撤去CIDR。第13 天早晚观察母牛发情，观察到发情后的12h 进行输精，隔10～12h 再次输精，连续输精2～3 次。埋植CIDR 和配种时注射维生素A、维生素D、维生素E 注射液5mL，配种时注射2 支促排3号。结果显示：该方案处理雷琼牛，每头平均回收卵数为8.9 枚，平均有效胚数为4.1 枚[20]。

2.2.2 PG+FSH+PG

（1）对比利时牛的处理情况和效果

在10 头比利时牛供体牛发情周期中的任意一天肌注PGF2α5mL，11d 后重复注射PGF2α5mL，第二次打完PGF2α后观察发情（发情当天计为第0 天），第9 天进行超排处理。按4 天8次递减法注射FSH，第11 天注射FSH 每头牛同时注射5mL PGF2α。第13 天早晚观察发情，发情后的10h 给予第一次输精，6h 后重复输精，每头牛输精2～3 次，每次输2 支冻精。结果显示：该处理超排有效率为90.00%，平均回收胚胎数5.33 枚，平均可用胚胎数3.44 枚[21]。

（2）对和牛的处理情况和效果

对7 头和牛供体牛肌肉注射0.4mg PG，10d后再次肌注0.4mg PG。第11d 开始连续4d 8 次（早上7:00，晚上19:00）递减肌注FSH（3、2.5、2、1mL）（Folltropin-V，400mg NIH/ 瓶，20mL生理盐水稀释），在第13 天晚上和第14 天早上肌注FSH 同时，每头牛肌注0.4mg PG。第15 天晚上给予第1 次输精，第16 天中午给予第2 次输精，输精同时每头牛注射25μg 促排3 号，第二次输精后第7 天冲胚。结果显示：该处理和牛超排有效率为100.00%，平均回收胚胎数11.29枚，平均可用胚胎数5.89 枚[22]。

2.2.3 CIDR+GnRH+FSH+PG

（1）对和牛的处理情况和效果

在10 头和牛供体牛确认自然发情排卵后阴道内放置CIDR（第0 天），第7 天肌肉注射GnRH 100mg；间隔3d 后（第10 天）应用FSH 20U 用生理盐水稀释后，分3d 减量注射，在第12 天最后一次注射FSH 的同时，取出CIDR，注射PG 诱发排卵；2d 后出现发情（第14 天），并输精一支精液，第21 天冲胚。结果显示：该处理直检黄体数共115 个，回收胚胎88 枚，平均每头8.8 枚，回收率77%，其中受精卵62 枚，受精率70.45%[23]。

（2）对荷斯坦奶牛的处理情况和效果

对18 头荷斯坦奶牛供体牛进行B 超检查，在发情周期第8 天确认供体牛卵巢黄体存在时注射2mL GnRH，同时阴道内放置1.38g 孕酮CIDR。从第11～14 天开始，给予总量400mg FSH，连续4d 早晚间隔12h 8 次递减处理（70、60、40 和30mg）。第13 天早晚注射2mL 前列腺素2 次，第14 天撤去CIDR，第15 天，给 药2mLGnRH。在确认发情后，对发情的奶牛使用牛性控精液输精2 次（间隔12 小时）。在第22 天（人工授精后第7 天）通过非手术冲洗收集胚胎。结果显示：该处理平均回收胚胎数11.50 枚，平均可用胚胎数6.86[24]。

3 影响超排效果的因素

超排效果是指供体对外源促性腺激素的反应能力，卵巢卵泡发育情况、卵泡数量、卵泡大小、排卵情况、排卵后黄体的数量、回收胚胎数量和可用胚数量是影响超排效果的主要客观表现。影响牛超排效果的因素众多且复杂，这包括了供体牛的自身因素和外部因素。

供体牛自身因素主要与超排时牛年龄与胎次、生产性能、发情状态和卵巢机能、体况和健康状况等；外部因素主要有供体牛饲粮水平与管理方式、激素类别与来源和注射方式与剂量、环境与季节、超排处理程序、精液品质、冲胚方法和冲胚人员技术等。

日常饲养管理中，牛易受到惊吓、顶架以及饲粮变化等外界刺激的影响，因此，供体牛应分群管理，饲喂营养均衡的全混合日粮，同时补充足够的清洁饮水，注重圈舍卫生，以减少饲养过程中对超排效果带来的负面影响，保证超排工作顺利完成。

4 小结

目前我国主要畜种的生产水平与发达国家相比差距明显。增加良种覆盖率、提高单产水平是缩小差距的必要手段。利用胚胎工程技术充分挖掘种质资源和繁殖潜力，是大幅加速特色畜种繁育进度的一把利剑。超数排卵技术是家畜胚胎移植技术体系中至关重要的一个环节，该技术已广泛应用到了牛的繁殖生产中，超排可以一次获得大量优质卵子，使得优良后代数几倍的增加甚至几十倍的增加，大大加快优良品种的扩繁速度。供体牛超排效果不稳定性和不可预测性仍然是制约牛体内胚胎生产的重要因素。在体内胚生产过程中，通过超排技术优化，提高可用胚胎的数量是一个至关重要的过程。因此，如何筛选、优化不同激素超排方案来有效降低生产成本、提高胚胎移植效率，乃至提升优良畜种利用率是目前研究的主要问题，也是今后努力的方向。