徐书静，沈锦涛，刘佳，黄悦，余硕，余云舟，孙黔云，戴秋云

（1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550000；2.军事科学院军事医学研究院生物工程研究所，北京 100071；3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550014）

A 型肉毒毒素（botulinum toxin A，BoNT/A）是目前已知毒性最强的生物毒素，由1 个轻链和1 个重链通过二硫键连接而成［1-2］。轻链为含锌离子的肽链内切酶，可特异性切割神经蛋白SNAP-25，阻止乙酰胆碱释放，导致中毒［2-4］。抗毒素治疗是临床上用于治疗肉毒中毒的主要手段［5-6］，但其仅可中和血液或体液中的肉毒毒素，对已经进入神经细胞的毒素无效。开发轻链抑制剂是全面解决肉毒中毒问题的有效手段，目前已报道的轻链抑制剂主要有羟肟酸类［7-9］、喹啉类［10-11］、硒唑类［12］和多肽类［13-16］等，但均存在半衰期短、体内活性不佳等缺点。原因是BoNT/A 轻链极难降解，半衰期达数周［17］，而一般抑制剂半衰期仅数小时，难以达到解毒目的。目前，BoNT/A 轻链抑制剂的设计仍面临很大挑战。CPI-1（IC50=0.27 μmol·L-1）是近年来发现的一种活性最高的环肽类轻链抑制剂，由8 个氨基酸组成〔C（Dab）RWTKCL-NH2〕（Dab：L-2，4-二氨基丁酸）［16］。但该肽稳定性及体内活性不佳。为提高其抑制活性、进入细胞的能力及稳定性，本研究合成了CPI-1 衍生物，在CPI-1 的N 端或C 端引入不同性质的氨基酸或长链，测定其抑制BoNT/A 轻链活性、抗酶解稳定性及小鼠体内抗毒素毒性作用，以获得活性更高、抗酶解稳定性更好的BoNT/A 轻链抑制剂。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器和动物

Rink 树脂，天津南开合成有限公司；9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc）保护氨基酸、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（O-benzotriazole-N，N，N′ ，N′-tetramethy l-uranium-hexafluorophosphate，HBTU）、羟基苯并三唑（1-hydroxybenzotrizole，HOBt），上海吉尔生化有限公司；辛酸（>98%），北京伊诺凯有限公司；月桂酸（≥99%）、肉豆蔻酸（99%）和软脂酸（99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化学试剂，北京国药有限公司。

LC424 为从BoNT/A 轻链中截取的一个片段，SNAPtide 来源于SNAP-25189-202，包含轻链识别位点Q197-R198，两端分别标记有荧光基团FITC-1和淬灭基团Dabcyl。LC424 的表达及SNAPtide 的合成及纯化按本实验室前期文献进行［18］。

多肽合成仪（Sophus），德国Zinsser Analytic公司；真空冷冻干燥机（Alphal-2），德国Christ 公司；高效液相色谱C18 分析柱（Agilent Eclipse Plus C18）、C18 纯化柱（Agilent 10 Prep-C18）及高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity Ⅱ、Agilent 1200 Series），美国安捷伦公司；半制备型高效液相色谱仪（Waters Delta Prep 4000、Waters 2489），美国Waters公司；多功能酶标仪（EnSpire™）和384孔黑板（OptiPlate-384F），美国铂金埃尔默公司；质谱仪（MicrOTOF QⅡ），德国Bruker公司。

6～8周龄KM 小鼠，雌雄各半，体重18～20 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物许可证编号：SCXK（京）2019-0010。KM 小鼠于室温下洁净环境中喂养，保证充足的食物及水源。动物实验由军事医学研究院实验动物伦理委员会审查批准，动物伦理审核编号2021068。

1.2 目标肽固相合成、色谱纯化及鉴定

主要合成2 类CPI-1 衍生物：①在CPI-1 C 端引入亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和谷氨酸（Glu）等氨基酸修饰的非长链衍生物；②在CPI-1 C 端引入侧链被硬脂酸修饰的Lys（在其序列中插入Leu或Gly作连接体），或是在CPI-1 N端引入辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸及软脂酸修饰的长链衍生物。具体合成方法见图1，具体序列见表1。

Fig.1 Synthesis scheme of CPI-1 C-terminal and N-terminal derivatives modified by long chain carboxylic acids.A：synthesis of CPI-1 derivatives modified by long chain at C-terminus；B：synthesis of CPI-1 derivatives modified by long chain at Nterminus. X1 and X2 are 0，or L，G，respectively；Xn is fatty acids of different lengths. Fmoc：9-fluorenylmethyloxycarbony；Acm：acet⁃amidomethyl；Boc：t-butyloxycarbonyl；Pbf：2，2，4，6，7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl；tBu：tert-butyl；HOBt：1-hydroxy⁃benzotriaole；DMF：N，N-dimethylformamide；DTT：dithiothreitol；TFA：trifluoroacetic acid；Tip：triisopropylsilane.

Tab.1 Amino acid sequence of N-terminal and C-terminal derivatives of CPI-1 and inhibitory activity on botulinum toxin A light chain（LC424）

①非长链修饰的CPI-1 C 端衍生物的合成：首先在树脂上固相合成肽-树脂，采用裂解剂（88%三氟乙酸/5% H2O/5%二硫苏糖醇/2%三异丙基硅烷）裂解后，线性肽空气氧化折叠关环得到目标肽［19］。②C端用硬脂酸修饰的Lys修饰的CPI-1衍生物的合成（图1A）：硬脂酸修饰的Lys 的合成参照文献方法进行［20-21］。合成时将硬脂酸修饰的Lys偶合在序列C 端，并在其中插入Leu 或Gly 作为连接体。固相合成线性肽后，保留最后1 个氨基酸的N端Fmoc 保护基，加入5 倍摩尔量I2/、二甲基甲酰胺（DMF）溶液，使2 个半胱氨酸（Cys）在树脂上氧化成环，后脱除Fmoc保护基，裂解得目标肽。③N端用长链羧酸修饰的CPI-1衍生物的合成（图1B）：在树脂上固相合成带有Fmoc 保护基的CPI-1 线性肽，然后加入5 倍摩尔量的I2/DMF 溶液，使2 个Cys在树脂上氧化成环，脱除Fmoc保护基，再分别偶联辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸，裂解后得目标肽并经高效液相色谱纯化。高分辨质谱法测定目标化合物的精确相对分子质量。

1.3 荧光共振能量转移法测定目标肽对BoNT/A 轻链片段LC424的体外抑制活性

基于荧光共振转移法，参照文献及本实验室方法［18，22］测定目标肽对BoNT/A轻链LC424的体外抑制活性。首先将多肽抑制剂配置成不同浓度梯度（水溶性较差多肽采用DMSO 溶解）溶液。设置阴性毒素组（工作液+SNAPtide）、阳性毒素组（工作液+LC424+SNAPtide）、实验组（工作液+LC424+多肽+SNAPtide），每组3 复孔。然后按照工作液、LC424、多肽、SNAPtide（待LC424 与多肽孵育0.5 h 后加入）的顺序加入384 孔板中，总体积为50 μL，37 ℃下检测其荧光值变化。以523 nm 处荧光发射值对时间做图，直线的斜率代表反应速率（v）。以不加多肽时的反应速率为v0，加入多肽后的反应速率为vi，抑制率=（1-vi/v0）×100%。采用Y=bottom+（top-bottom）/〔1+10^（logIC50-X）〕×Hill⁃Slope 方程拟合剂量曲线，top 指最大响应，Bottom指基线响应，Hill-Slope指曲线的斜率。

1.4 高效液相色谱法HPLC测定目标肽的胰蛋白酶酶解率

选取胰蛋白酶对CPI-1 及其部分衍生物的稳定性进行考察，具体操作步骤参考文献［23］。将500 μL胰蛋白酶（200 μg·L-1）与500 μL多肽（500 μmol·L-1）混合，37 ℃孵育。每小时分别取样100 μL，迅速加入100 μL 终止液（50 μL 乙腈，50 μL 去离子水），振荡混匀，离心（12 210×g，10 min），取上清，采用已验证的HPLC 方法进行分析，重复测量3 次。色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18分析柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相A 为含0.1% TFA 的去离子水，B为含0.1% TFA 的乙腈；梯度洗脱：0～1 min，5%B～10% B；1～25 min，10% B～50% B，25～31 min，50%B～95%B；流速：1 mL·min-1；检测波长：214 nm。上样量为100 μL。降解率（%）=（S0-St）/S0×100%（S0：0 min时样品峰面积；St：tmin时样品峰面积）。

1.5 小鼠体内目标肽对A型肉毒毒素毒性的影响

1.5.1 毒素与抑制剂混合实验

将小鼠随机分为毒素组、毒素+CPI-1 组和毒素+CPI-1 衍生物〔CPI-1-L（1），CPI-1-W（3），CPI-1-Y（4），CPI-1-R（5），CPI-1-K（6），CPI-1-K（stearic）GG（8），CPI-1-LK（stearic）GG（9），CPI-1-LGK（stearic）GG（10），C8-CPI-1（11），C12-CPI-1（12），C14-CPI-1（13）及C16-CPI-1（14）〕组，每组8或10只，雌雄各半。分别用生理盐水、CPI-1、CPI-1 衍生物与BoNT/A 共孵育30 min 后ip 给予小鼠，每12 h 记录1次小鼠存活数，观察72 h内小鼠存活率。毒素剂量为每只2×LD50或2.5×LD50〔稀释液（mmol·L-1）：4，KH2PO4；6，Na2HPO4·12H2O；100，NaCl；2‰明胶；pH=7.0〕，多肽抑制剂剂量为5 mg·kg-1（DMSO 或H2O溶），注射体积为200 μL。

1.5.2 解毒实验

分组同1.5.1，每组10 只，雌雄各半。由于BoNT/A 中毒的平均潜伏期为数小时［4，24-25］，另考虑到救治时间方便性及多肽半衰期，注射BoNT/A 2和6 h后，分别ip给予生理盐水、CPI-1及CPI-1衍生物〔CPI-1-L（1），CPI-1-LK（stearic）GG（8），CPI-1-LGK（stearic）GG（10），C12-CPI-1（12）和C16-CPI-1（14）〕进行解救，每12 h 记录1 次小鼠存活数，观察72 h 内小鼠存活率。BoNT/A 剂量为每只2×LD50，体积为20 μL，多肽给药剂量为5 mg·kg-1，体积为200 μL。采用乘积极限法（Kaplan⁃Meier）绘制生存曲线。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 目标肽的鉴定

典型多肽的HPLC 分析结果见图2，经C18 柱纯化后所有多肽纯度均>95%。经质谱鉴定所有多肽相对分子质量与理论相对分子质量一致（表1）。

Fig.2 High performance liquid chromatography（HPLC）of typical CPI-1 derivatives. A：CPI-1-L（1）；B：CPI-1-R（5）；C：CPI-1-K（stearic acid）GG（9）；D：C12-CPI-1（12）. Analytical conditions：Agilent Eclipse plus C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），mobile phase A and B were water containing 0.1% TFA and acetonitrile containing 0.1% TFA，respectively.Flow rate was 1.0 mL·min-1，λ=214 nm.Elution gradient for Fig. 2A and 2B：1-25 min，10% B-50% B；25-31 min，50% B-95% B；31-32 min，95% B-5% B；Elution gradient for Fig.2C and 2D：1-25 min，30% B-90% B；25-31 min，90% B-95% B，31-32 min，95% B-5% B.

2.2 目标肽对BoNT/A 轻链LC424 的体外抑制活性

多肽对BoNT/A 轻链LC424的抑制活性与剂量关系见图3，IC50值见表1。与CPI-1相比，在C端引入疏水氨基酸Leu、Trp、Tyr 后，化合物抑制活性〔IC50=（0.06±0.01），（0.14±0.00）和（0.15±0.01）μmol·L-1〕较CPI-1〔IC50=（0.27±0.02）μmol·L-1〕［25］提高3.5～0.8倍（P<0.01），引入碱性氨基酸Arg和Lys后，抑制活性〔IC50=（0.15±0.01）和（0.24±0.05）μmol·L-1〕分别提高80.0%（P<0.01）及12.5%，但引入酸性氨基酸Glu 后抑制活性〔IC50=（1.26±0.28）μmol·L-1〕降低78.6%（P<0.01）。在C 端或N 端引入疏水性长链进行修饰后抑制活性（IC50>1.36 μmol·L-1）下降>80%（P<0.01）。

Fig.3 Inhibitory activity-dose curves of CPI-1 derivatives interacting with botulinum toxin A (BoNT/A) light chain LC424. See Tab.1 for the evaluated method of IC50. A：non long-chain CPI-1 derivatives；B：long-chain CPI-1 derivatives.

2.3 目标肽的胰蛋白酶稳定性

在胰蛋白酶100 μg·L-1作用下，CPI-1及部分典型衍生物降解率见图4。结果表明，4 h 时CPI-1、CPI-1-GL 及CPI-1-W 降解率分别为（98.36±0.01）%、（98.00±0.02）%及（99.06±0.00）%，几乎完全降解；C12-CPI-1 和CPI-1-K（stearic）GG 的降解率分别为（69.24±0.04）%和（50.90±0.01）%，与CPI-1 相比均显著降低（P<0.01）。8 h 时C12-CPI-1和CPI-1-K（stearic）GG 的降解率分别为（82.56±0.02）%和（78.09±0.09）%，与CPI-1 相比，降解率显著降低（P<0.05，P<0.01），表明其对胰蛋白酶的稳定性增强。

Fig.4 Trypsin degradation activity of CPI-1 and its typical derivatives. The mixture of trypsin（200 μg·L-1）and polypeptide inhibi⁃tors（500 μmol·L-1）was incubated at 37 ℃，and samples were taken every hour for HPLC detection. Analytical conditions：Agilent Eclipse plus C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），the elution gradient in Fig.4A，4B and 4C was the same as Fig. 2A，the elution gradient in Fig. 4D and 4E was the same as in Fig.2C. A：CPI-1；B：CPI-1-GL；C：CPI-1-W；D：CPI-1-K（stearic）GG；E：C12-CPI-1；F：degrada⁃tion rate-time curves.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01,compared with CPI-1 group.

2.4 小鼠体内解毒活性

2.4.1 毒素与多肽抑制剂混合实验

氨基酸修饰衍生物体内活性结果（图5A～C）表明，2×LD50BoNT/A 与多肽共孵育30 min 后ip 给予小鼠24 h 后，毒素组及毒素+CPI-1 组小鼠全部死亡。72 h 后，毒素+衍生物CPI-1-W、CPI-1-R 和CPI-1-K 组小鼠存活率为12.5%，其余各组小鼠全部死亡。与毒素组及毒素+CPI-1 组相比，毒素+CPI-1-L、CPI-1-W、CPI-1-Y、CPI-1-R和CPI-1-K组小鼠72 h内存活率明显提高（P<0.05，P<0.01）。

Fig.5 Survival curves of mice after intraperitoneal co-injection of BoNT/A and CPI-1 derivatives or rescued by some CPI-1 derivatives. A-C：intraperitoneal co-injection of BoNT/A（2×LD50）and 5 mg·kg-1 CPI-1 derivatives；D-F：intraperitoneal co-injection of BoNT/A（2.5×LD50）and 5 mg·kg-1 CPI-1 fatty acid derivatives（n=10）；G-I：2 and 6 h after injection of BONT/A (2×LD50)，CPI-1 derivatives（5 mg·kg-1）were ip injected（n=10）. The survival rates of mice were recorded every 12 h for 72 h. The differ⁃ences in survival curves between groups were determined using Log rank（Mantel-Cox）test. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with CPI-1 group.

脂肪酸修饰衍生物的体内活性结果（图5D～F）表明，2.5×LD50BoNT/A 与多肽共孵育30 min 后ip给予小鼠72 h 后，毒素+CPI-1-LK（stearic）GG 和C12-CPI-1组小鼠存活率均为10%，其余各组小鼠均死亡。与毒素组相比，毒素+CPI-1组及毒素+CPI-1-LK（stearic）GG，C12-CPI-1，C14-CPI-1 和C16-CPI-1组小鼠72 h 内存活率明显提高（P<0.05，P<0.01），毒素+CPI-1-K（stearic）GG，CPI-1-LGK（stearic）GG及C8-CPI-1组无明显差异。与毒素+CPI-1组相比，毒素+各衍生物组均无明显差异。

2.4.2 解毒实验结果

2×LD50BoNT/A 攻毒72 h 后，毒素+CPI-1-L组小鼠存活率为10%，毒素+C12-CPI-1 组小鼠存活率为30%，其余各组小鼠均全部死亡（图5G～I）。与毒素组相比，毒素+C12-CPI-1 组小鼠72 h 内存活率明显提高（P<0.05），而毒素+CPI-1 组及其余各组无明显差异；与毒素+CPI-1组相比，毒素+各衍生物组小鼠无明显差异。

3 讨论

本研究合成了长链修饰CPI-1 的N 端或C 端衍生物，由于引入疏水性长链后线性肽溶解度显著降低，在溶液中无法获得正确折叠产物，因此采用树脂上直接碘氧化法使2 个Cys 氧化关环，然后进行裂解及纯化。

多肽对BoNT/A 轻链体外抑制活性测定结果显示，在CPI-1 的C 端引入疏水性或碱性氨基酸Arg后，抑制活性明显提高。CPI-1-L 活性提高3.5 倍，是目前发现的活性最高的BoNT/A 轻链抑制剂。但引入疏水性较强的硬脂酸或酸性氨基酸后抑制活性反而下降。而在N 端修饰的衍生物中，随着脂肪链的增长抑制活性反而下降。表明C端适当引入疏水基团可提高活性，但如引入疏水基团体积过大，不利于突变体与轻链活性位点结合。N端修饰与此类似。

酶解稳定性结果显示，在CPI-1 的N 或C 端引入长链后衍生物抗酶解能力增强。这可能是长链结构掩蔽了酶切位点，使其稳定性提高。

小鼠体内解毒活性测定结果显示，在毒素与多肽混合实验中，非长链修饰CPI-1 衍生物CPI-1-L、CPI-1-W、CPI-1-Y、CPI-1-R和CPI-1-K及长链修饰CPI-1 衍生物CPI-1-LK（stearic）GG、C12-CPI-1、C14-CPI-1及C16-CPI-1均可有效提高小鼠72 h内存活率（P<0.05）。而解毒实验中仅CPI-1 N 端月桂酸修饰衍生物C12-CPI-1 可提高中毒小鼠72 h 内存活率（P<0.01）。这可能是合适的烷基长度利于其进入细胞并具有较好的抗酶解能力，使CPI-1的半衰期延长，提高了小鼠的存活率。

总之，在CPI-1 的C 端引入疏水或碱性氨基酸Arg 可显著提高CPI-1 对轻链的抑制活性，脂肪链修饰的CPI-1 抗酶解能力增强，CPI-1 N 端月桂酸修饰衍生物具有显著的体内抗BoNT/A活性。