战世佳，张璇，张瑶，郭金鑫，洪恩宇，杨慧，鲁洁，常艳，郭永丽

（国家儿童医学中心，首都医科大学附属北京儿童医院，儿科重大疾病研究教育部重点实验室，北京市儿科研究所，儿童耳鼻咽喉头颈外科疾病北京市重点实验室，北京 100045）

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）起源于原始神经嵴，是儿童最常见颅外恶性实体肿瘤，约90%患儿首诊年龄<5 岁［1］。NB 发病率约占儿童肿瘤8%～10%，死亡率约占儿童肿瘤死亡率10%，被称为“儿童肿瘤之王”［2］。根据不同生物学和临床特征，可将NB 分为低危、中危和高危，中低危NB 患儿的肿瘤可自然消退或通过手术切除，患儿5 年总生存率约高达97%，但高危NB 患儿在手术、放化疗和造血干细胞移植等治疗后仍易复发进展，5 年总生存率<50%［1，3］。MYCN扩增是目前公认的NB 患儿预后不良因素，是诊断高危NB 的关键分子标志物，近40%高危NB 患儿存在MYCN扩增，诊疗难度大，易复发或进展，且预后极差［4-5］。据报道，MYCN属于MYC癌基因家族成员，由于其蛋白质结构特点，不易被小分子药物结合，目前仍然“无药可靶”，导致MYCN扩增高危NB 患儿缺乏有效干预方式［6-7］。因此，解析MYCN扩增高危NB 中新的关键调控因子及作用机制，将可能为其临床治疗提供理论基础和潜在靶标。

溶质载体家族7 家族成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）基因编码12 次跨膜蛋白，含有501个氨基酸残基，其作为轻链亚基与重链亚基溶质载体家族3成员2组成胱氨酸/谷氨酸逆向转运体系统（Xc-系统），负责特异性转运胱氨酸和谷氨酸，将细胞外胱氨酸摄入细胞内，为合成谷胱甘肽提供原料，同时将谷氨酸交换转运至细胞外，维持细胞的氧化还原平衡，从而抑制铁死亡［8-11］。据报道，SLC7A11 在多种人类癌症中普遍高表达，并促进肿瘤生长、侵袭和转移等，与不良预后密切相关［12］。有研究表明，在胰腺导管腺癌细胞中，敲低SLC7A11 能抑制肿瘤细胞生长和纤维化的潜力［13］；在胶质母细胞瘤细胞系U87 中，沉默SLC7A11 会增加细胞中花生四烯酸脂氧合酶3 的活性，从而促进胶质母细胞瘤铁死亡，抑制小鼠原位肿瘤的生长和转移［14］；在KEAP1基因突变的肺癌细胞中，高表达SLC7A11 可抑制铁死亡，从而导致放疗抵抗［15］。综上，SLC7A11作为潜在促癌分子参与了多种肿瘤的发生发展。然而，目前SLC7A11在NB中，尤其是MYCN扩增高危NB中的功能仍未见报道。

本研究拟检测分析MYCN扩增NB 细胞系和临床样本中SLC7A11mRNA 水平，以及与患儿预后相关性，并进一步通过敲低SLC7A11 表达，研究SLC7A11 对MYCN扩增高危NB 增殖和克隆形成能力的影响，为寻找MYCN扩增高危NB 的靶向治疗新策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM 培养基、MEM 培养基和胎牛血清，美国Corning 公司；青链霉素双抗混合液和4%多聚甲醛，中科迈晨（北京）科技有限公司；胰蛋白酶，凯基生物；Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂、Trizol 试剂和靶向荧光素酶报告基因对照小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），美国Invitrogen 公司；BCA 蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 抗体（二抗）（31460）和荧光二抗（A11001），美国Thermo Fisher Scientific公司；结晶紫溶液，上海碧云天生物技术有限公司；HitransG P（感染增强液）（REVG005），上海吉凯基因医学科技股份有限公司；反转录试剂盒（RR036A），日本TaKaRa 公司；SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒（1725121）、1658001 电泳仪和1703930 转膜仪，美国Bio-Rad 公司；兔抗人SLC7A11 多克隆抗体（ab37185），英国Abcam公司；小鼠抗人N-MYC单克隆抗体（sc-53993），美国Santa Cruz 公司；兔抗人GAPDH 单克隆抗体（5174S）和小鼠抗人Ki-67单克隆抗体（9449T），美国Cell Signaling Technology公司；ECL 化学发光试剂盒，爱必信生物科技有限公司。

371CO2培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司；实时无标记细胞分析系统（real time xCELLi⁃gence analysis system，RTCA），艾森生物科学公司；5424R 低温高速离心机和5424 常温高速离心机，德国Eppendorf公司；ViiA7 实时定量PCR 仪，美国Applied Biosystems公司。

1.2 细胞和细胞培养

人NB 细胞系SH-SY5Y，SK-N-BE（2），CHLAC255 和IMR32 细胞购自美国模式培养物研究所。SH-SY5Y，SK-N-BE（2）和CHLA-C255 细胞培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗混合液的DMEM 完全培养基中，IMR32 细胞培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗混合液MEM 完全培养基中，置37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养。细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶-EDTA 溶液消化，129×g离心3 min 收集细胞。计数细胞，并调整至适当密度接种细胞，进行后续实验。

1.3 GEO 临床数据集和TARGET 数据库分析SLC7A11 mRNA 水平与MYCN 基因扩增状态和NB患儿预后相关性

Gene Expression Omnibus（GEO）数据库是由美国国立生物技术信息中心NCBI 创建的基因组数据库，是全球最大、最全面的公共基因数据库。从GEO 数据库网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载基因表达数据集GSE49710（2022年3月），其中包括498 例NB 患者的临床数据和NB 组织表达谱数据，生物信息学分析有无MYCN扩增NB 患儿中的SLC7A11表达水平。TARGET 数据库是针对儿童肿瘤的数据库，主要包括NB 和急性淋巴细胞/髓系白血病等儿童肿瘤的临床数据和转录组测序等信息。在统计NB 患者生存率时，利用TAR⁃GET 数据库（Therapeutically Applicable Research To Generate Effective Treatments，https：//ocg.can⁃cer.gov/programs/target）下载160 例NB 患儿临床数据和NB 组织表达谱数据（2022 年3 月），根据基因表达水平均值，将所有数据分成SLC7A11高表达组或低表达组，并使用Kaplan-Meier 方法绘制生存曲线。利用R2数据库（http：//r2.amc.nl）分析另一NB 的基因表达数据集GSE45547（Kocak-649）中有无MYCN扩增NB患儿中SLC7A11的表达水平，以及SLC7A11表达量与NB患儿预后相关性。

1.4 siRNA转染瞬时敲低SLC7A11基因表达

将SK-N-BE（2）细胞以1×108L-1的密度，每孔2 mL 细胞悬液接种于6 孔培养板中，待细胞密度达到20%～30%，按Lipofectamine RNAi MAX 试剂盒说明书步骤进行siRNA转染。设置靶向荧光素酶报告基因对照siRNA（siCtrl）组、实验siSLC7A11-1#组和siSLC7A11-2#组，siRNA 的转染终浓度为60 nmol·L-1，转染72 h 后进行下一步实验。委托广州锐博生物技术有限公司设计并合成了3 条靶向SLC7A11的siRNA 序列，本文中使用的siRNA 为其中敲低效果较好的2 条靶序（1#和2#），其靶序列为GGAAGAGATTCAAGTATTA 和CTTGCAATATGTATATCCA。

1.5 慢病毒稳定敲低SLC7A11基因SK-N-BE（2）细胞系构建

利用与siRNA 相同的靶序列，构建靶向敲低SLC7A11的慢病毒短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）：shSLC7A11-922#和shSLC7A11-923#。将4.8×105个SK-N-BE（2）细胞接种于6 cm细胞培养皿内，37 ℃培养16～24 h，至细胞汇合度为20%～30%，细胞换液成DMEM 完全培养基和HitransG P 的混合液，病毒以感染复数（MOI）为10 感染细胞，感染后24 h 换液，72 h 后检测感染效率和敲低效果。

1.6 RT-qPCR检测细胞内SLC7A11基因表达水平

取SK-N-BE（2），IMR32，CHLA-255 和SH-SY5Y细胞及1.4 和1.5 处理的细胞，用Trizol 试剂分别提取其总RNA，用PrimeScript RT Master Mix 反转录试剂盒合成cDNA，合成体系为RNA 1 μg，5×PrimeScript Mix 2 μL，补无RNA 酶水至10 μL。按SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR 扩增检测。反应条件为95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 个循环。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt法计算SLC7A11的相对表达水平。PCR 引物序列来自Primer Bank 网站（https：//pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）（表1），由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.7 RTCA监测细胞增殖

RTCA 通过微电子生物感应芯片，将信号转化为特定参数——细胞指数，无需任何标记即可实时检测衡量活细胞的生长状态，包括细胞数目、形态、黏附和大小等综合变化。将1.4 构建的细胞消化成单细胞悬液，以每孔5×103个细胞接种到E-plate 16 孔板中，每组3 个复孔。将E-plate 16 孔板置37 ℃，5% CO2条件下培养，通过RTCA分析仪监测并记录细胞指数值，连续监测125 h后，分析记录结果并绘制生长曲线，并用Delta细胞指数表示细胞增殖。

1.8 Western 印迹法检测SLC7A11 和N-MYC 蛋白表达水平

分别取1.4 和1.5 构建的细胞，常规提取蛋白，采用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白质样品浓度。提取的蛋白质样品用10% SDS-PAGE 电泳分离后，250 mA 恒流转印2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗〔SLC7A11（1∶1000），N-MYC（1∶2000）和GAPDH（1∶5000）〕，4 ℃摇床孵育过夜，次日，用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加HRP 标记的二抗室温摇床孵育1 h，用ECL 化学发光试剂盒在暗室曝光显影。用AlphaView SA 软件定量分析蛋白质条带的积分吸光度值，以目标蛋白与内参蛋白条带积分吸光度值的比值表示目标蛋白的相对表达水平。

1.9 平板克隆形成实验

取1.5 构建的细胞以每孔600 个接种到6 孔板中，每组3个复孔。于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养，每隔3 d更换培养基并观察细胞状态。第14天在显微镜下观察到直径>1 mm 的细胞集落，则终止培养。使用4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，结晶紫染色15 min，PBS 洗涤细胞，晾干并拍照。用AlphaView SA软件分析计数细胞集落个数。

1.10 免疫荧光检测Ki-67表达水平

取1.4 构建的细胞，以7×107L-1的密度，每孔500 μL 细胞悬液接种在24 孔板内的玻片上，培养24 h后，以4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗细胞1遍；用0.3% Triton X-100冰上打孔破膜10 min，接着在含3% BSA PBS中室温封闭1 h。加抗Ki-67抗体（1∶50 000）4 ℃孵育过夜，PBST 洗3 次，每次5 min。在避光条件下加荧光二抗（1∶1000）室温孵育1 h，PBST 洗3 次，每次5 min；加Hoechst33342（1∶2000）染核后封片，在激光共聚焦显微镜20 倍视野下拍照。通过Image J 软件分析图片荧光强度，以Ki-67阳性细胞比例反映Ki-67蛋白表达水平。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 SLC7A11 在MYCN 扩增高危NB 临床样本中高表达，且与患儿预后呈负相关

GSE49710（SEQC-498）数据集应用RNASeq 和微阵列得到了498 例NB 组织样本的基因表达谱，而R2 数据库GSE45547（Kocak-649）数据集则包含649 例NB 样本的表达谱。利用这2 个数据分析发现，与MYCN不扩增（MYCN-non-amp）的NB样本相比，SLC7A11在MYCN扩增（MYCN-amp）的NB样本中高表达（P<0.05，图1A；P<0.01，图1C）。通过分析TARGET 数据库中160例NB患儿的转录组数据，发现10 年总体生存率在SLC7A11高表达的NB 患儿约为40%，而在SLC7A11低表达的NB患儿约为55%（P<0.05，图1B）。Kocak-649数据集也显示，SLC7A11高表达的NB 患儿生存率低于SLC7A11低表达者（P<0.01，图1D），表明SLC7A11表达量与NB 患儿生存率呈负相关。综合以上结果，提示SLC7A11参与NB的发生发展。

Fig.1 Correlations between expressions of solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11) and clinical features of neuroblastoma（NB）.A:SLC7A11 expression in clinical patient samples with MYCN amplification (MYCN-amp)or MYCN non-amplification(MYCN-non-amp).(SEQC-498,GSE49710 dataset).±s,n=92(MYCN-amp),n=401(MYCN-non-amp).＊P<0.05,compared with MYCN-non-amp group. B: Kaplan-Meier analysis of NB prognosis and SLC7A11 expression correlation (TARGET database). n=49 (high SLC7A11 expression group, red lines), n=111 (low SLC7A11 expression group, blue lines). C: SLC7A11 expression in clinical patient samples with or without MYCN amplification (Kocak-649, GSE45547 dataset). ±s, n=93 (MYCN-amp), n=550 (MYCN-non-amp). ＊＊P<0.01, compared with MYCN-non-amp group. D: Kaplan-Meier analysis of NB prognosis and SLC7A11 expression correlation (Kocak-649 database). n=119(high SLC7A11 expression group,red lines),n=357(low SLC7A11 expression group,blue lines).

2.2 SLC7A11在MYCN扩增NB细胞系中高表达

RT-qPCR 检测结果（图2）显示，SLC7A11在MYCN扩增NB 细胞系SK-N-BE（2）和IMR32 细胞中的表达量显著高于MYCN非扩增NB 细胞系CHLA-255 和SH-SY5Y 细胞（P<0.01）。提示SLC7A11可能在MYCN扩增NB 细胞中发挥功能调控作用。

Fig.2 SLC7A11 mRNA levels in NB cell lines detected by RT-qPCR. CHLA-255，SH-SY5Y and SK-N-BE（2）cells were incubated with DMEM and IMR32 cells were incubated with MEM for 72 h. ±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with CHLA-C255 group；##P<0.01，compared with SH-SY5Y group.

2.3 瞬时敲低SLC7A11 显著抑制MYCN 扩增NB细胞系SK-N-BE（2）细胞活力

RT-qPCR和Western印迹结果显示，与siCtrl组相比，siSLC7A11-1#和siSLC7A11-2#组SLC7A11mRNA（图3A1）和蛋白（图3B）表达水平均显著下降（P<0.01），表明靶向SLC7A11的siRNA 具有较好的敲低效果，而siSLC7A11-1#和siSLC7A11-2#组MYCN的mRNA（图3A2）和N-MYC 蛋白（图3B）水平均未发现显著变化。利用显微镜观察细胞明场以及固定后结晶紫染色的细胞数目结果显示，瞬时敲低SLC7A11 72 h后，SK-N-BE（2）细胞数目明显少于siCtrl组（图3C）。RTCA动态监测结果（图3D）显示，与siCtrl组相比，随着时间延长，瞬时敲低SLC7A11使SK-N-BE（2）的细胞指数显著减小（P<0.01），提示细胞增殖能力下降。以上结果表明，敲减SLC7A11 可显著抑制MYCN扩增NB 细胞的活力。

Fig.3 Effect of transient knockdown of SLC7A11 on proliferation viability of SK-N-BE（2）cells. SK-N-BE（2）cells were transfected with two independent SLC7A11-targeting small interfering RNA（siRNA）（siSLC7A11-1# and siSLC7A11-2#）or nontargeting control siRNA（siCtrl）used at a final concentration of 60 nmol·L-1 for 72 h. A：mRNA levels of SLC7A11 and MYCN in SK-N-BE（2）cells transfected with siRNA by RT-qPCR. ±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with siCtrl group；B：expression levels of SLC7A11 and N-MYC protein in SK-N-BE（2）cells transfected with siRNA by Western blotting，B2 was the semi-quantitative result of B1. ±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with siCtrl group. C：bright field（C1）and crystal violet（C2）staining images of SK-N-BE（2）cells 72 h after siRNA transfection. D：SK-N-BE（2）cell proliferation was dynamically observed for more than 120 h after siRNA transfection by real-time cell analysis.±s，n=4.＊＊P<0.01，compared with siCtrl group.

2.4 瞬时敲低SLC7A11 导致MYCN 扩增NB 细胞系SK-N-BE（2）细胞中Ki-67表达量减少

免疫荧光结果（图4）显示，siSLC7A11-1#和siSLC7A11-2#组细胞中Ki-67 阳性比例显著低于siCtrl组细胞，分别为对照组的37%和24%，这表明瞬时敲低SLC7A11导致NB细胞增殖能力降低。

Fig.4 Ki-67 expression in SK-N-BE（2）cells by immunofluorescence assay. SK-N-BE（2）cells were transfected with siCtrl，siSLC7A11-1#or siSLC7A11-2#for 72h.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P<0.05，compared with siCtrl group.

2.5 稳定敲低SLC7A11 抑制MYCN 扩增NB 细胞系SK-N-BE（2）细胞克隆形成

如图5A1和5B所示，与稳定敲低对照组（shCtrl）相比，shSLC7A11-922#和shSLC7A11-923#组中SLC7A11 mRNA 和蛋白水平均显著降低（P<0.01）。在稳定敲低SLC7A11的细胞中检测MYCN的mRNA 和N-MYC 蛋白水平，结果与瞬时敲低类似，MYCN水平未见显著变化（图5A2 和5B）。与shCtrl 组（53.3±5.0）相比，shSLC7A11-922#组（3.0±1.0）和shSLC7A11-923#组（12.3±3.2）细胞集落数明显减少（P<0.01）（图5C），表明稳定敲低SLC7A11 能够抑制NB 细胞克隆形成能力，抑制MYCN扩增NB细胞增殖。

Fig.5 Effect of stable knockdown of SLC7A11 on SK-N-BE（2）colony formation. SK-N-BE（2）cells were infected with recombinant lentiviruses with one control short hairpin RNA（shRNA）or two independent shRNAs named shSLC7A11-922# and shSLC7A11-923#. A：mRNA levels of SLC7A11 and MYCN in lentivirus-infected SK-N-BE（2）cells by RT-qPCR. ±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with shCtrl group；B：expression levels of SLC7A11 and N-MYC protein in lentivirus-infected SK-N-BE（2）cells by Western blotting.B2 was the semi-quantitative result of B1.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with shCtrl group；C：SK-N-BE（2）cell colony forma⁃tion by crystal violet staining.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with shCtrl group.

3 讨论

MYCN基因是MYC 家族成员，能够编码转录因子N-MYC 蛋白［16］。MYCN基因扩增是高危NB的标志性特征，同时也是高危NB 的主要促癌驱动因素和预后危险因素。N-MYC 蛋白可通过多种方式促进NB 增殖、侵袭、转移和耐药等。N-MYC蛋白可上调细胞周期蛋白依赖性激酶2 和4 的活性，促进细胞周期进程［17］；促进黏着斑激酶表达，从而增强整合素信号通路，促进细胞侵袭和迁移［18］；通过上调双微体同源基因2 的表达，促进P53 泛素化降解，抑制NB 细胞凋亡，从而促进NB 化疗耐药［19］。近年来多研究发现，N-MYC 通过上调糖酵解相关分子如己糖激酶2 和乳酸脱氢酶A 的表达，维持成NB 细胞的有氧糖酵解表型［20］；参与脂质代谢，利用其转录因子特性促进SLC27A2基因转录翻译生成脂肪酸转运蛋白2，促进NB细胞摄取脂肪酸，增强甘油脂合成［21］。由于N-MYC 蛋白结构缺乏结合药物的“口袋”，导致该蛋白质目前仍“无药可靶”［6］，而靶向细胞代谢相关分子有可能为MYCN扩增高危NB治疗提供新思路。本研究通过解析MYCN扩增高危NB 中代谢等通路相关差异表达基因及功能，从而为NB临床治疗提供潜在靶点和新思路。

本研究通过分析NB 临床样本数据库，发现氨基酸代谢相关基因SLC7A11在MYCN扩增高危NB 中表达量升高，且SLC7A11表达量与NB 患儿生存率呈负相关。NB 细胞系检测发现，与MYCN非扩增NB 细胞系相比，SLC7A11在MYCN扩增细胞系中表达量显著升高。本研究基于MYCN扩增细胞系SK-N-BE（2）探究SLC7A11对高危NB细胞的调控功能，通过RTCA 技术、细胞克隆形成和免疫荧光法检测发现，干扰SLC7A11 表达能显著抑制NB 细胞增殖，导致肿瘤细胞增殖指标Ki-67 含量下降。表明SLC7A11 促进了MYCN扩增NB 细胞增殖，提示SLC7A11很可能在MYCN扩增NB的发生发展中发挥重要作用。SLC7A11 是细胞中氨基酸代谢的重要分子，其作为氨基酸的转运蛋白质，可促进胱氨酸的摄取和谷胱甘肽的生物合成，从而防止氧化应激和铁死亡，已成为肿瘤治疗中很有前景的治疗靶点［22］，然而SLC7A11 在NB 中的功能仍然未知，SLC7A11 与MYCN扩增的相关性也有待研究。本研究通过生物信息学分析和细胞实验证实，SLC7A11 在MYCN扩增的NB 组织中高表达，可促进MYCN扩增NB细胞增殖和肿瘤进展。目前已有研究发现了多个靶向SLC7A11 的小分子抑制剂，如依垃司汀（erastin）、咪唑酮（imidazolidone）和柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine）等，可通过阻断SLC7A11介导的胱氨酸摄取促进铁死亡，从而抑制肿瘤生长［23］，这些抑制剂的研发为靶向MYCN扩增高危NB 中高表达的SLC7A11 提供了可能，将有望抑制MYCN扩增高危NB 细胞增殖和肿瘤发生发展。

有研究表明，NB 细胞中的N-MYC 可促进SLC7A11 同家族成员SLC7A5 和SLC43A1 的表达，增强NB 细胞摄入异亮氨酸和亮氨酸等氨基酸；而高表达的SLC7A5 和SLC43A1 又可促进MYCNmRNA 翻译，形成正反馈环路，最终促进NB 细胞生长和肿瘤形成［24］。同时已有研究发现N-MYC 蛋白促进SLC7A11基因的转录［25］，但SLC7A11 是否调控MYCN的表达未见报道。本研究在瞬时敲低和稳定敲低SLC7A11的NB 细胞系中检测MYCNmRNA 和蛋白质水平，结果显示，敲低SLC7A11后细胞中的MYCN水平未见显著变化。由此可见，NB 中SLC7A11 可能不是MYCN基因转录和翻译相关调控分子。

综上，本研究从临床样本相关性出发，发现SLC7A11 在MYCN扩增高危NB 中高表达，且其表达量与NB 患儿生存率呈负相关。进一步功能实验表明，敲低SLC7A11能显著抑制MYCN扩增NB细胞的增殖和克隆形成能力。提示SLC7A11有望成为高危NB的潜在治疗靶点。