陈慧婷 王盛隆 白 丽

(山西省中西医结合医院肺病科,山西 太原 030013)

相关统计显示,我国每年死于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的患者有近百万,致残人数近千万[1]。在国外,COPD也是致残及致死率前五的疾病[2]。COPD患者主要表现为气道慢性炎症及气流受阻,同时还伴有气道黏膜高分泌,使得气道狭窄,影响肺功能。白细胞介素8(IL-8)/黏蛋白5ac(MUC5ac)通路在气道高分泌发展中占有重要地位,可通过激活该通路,调控MUC5ac表达,影响气道黏液分泌。IL-8通过调控该通路中核转录因子κB(NF-κB)的表达调控炎性反应,并调控MUC5ac表达。COPD患者该通路异常活化,促进炎症反复发展,持续的气道炎症反应会促使气道狭小,支气管平滑肌厚度增加,影响肺功能[3]。目前,COPD的治疗常选用糖皮质激素类药物,具有一定的疗效,但该类药物具有毒副作用。此外,由于COPD病程久,易反复发作,使得患者的经济费用增加,最终导致患者的依从性低,不易长期使用。近年来,中医对COPD的治疗逐渐成为研究热点。COPD属中医学“肺胀”“喘证”“咳嗽”等疾病范畴,主要累及肺,兼及脾、心、肾。其病因主要为水停痰凝、气虚气滞、痰瘀互结,在后期则兼见肾虚的证候[4]。根据辨证,本实验运用益气活血化痰方对其动物模型进行治疗。既往研究已经证实,益气活血化痰方可抑制COPD模型动物IL-8等炎症因子的增加,下调肺组织MUC5ac、NF-κB等蛋白的表达,改善肺功能,减少COPD的复发。基于此,本研究基于IL-8/MUC5ac信号通路探讨益气活血化痰方对COPD大鼠气道重塑及平滑肌厚度的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠53只,购自江苏艾菱菲生物公司,实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2021-1012,体质量200～300 g,鼠龄6～8周,适应性饲养1周后进行实验。

1.2 实验药物 益气活血化痰方药物组成:南沙参、黄芪、桔梗、茯苓、法半夏、紫菀各15 g,杏仁12 g,水蛭、百合各9 g,甘草6 g。将药物煎煮3次后浓缩成浸膏,生药量3.2 g/mL。冰箱中保存。

1.3 实验试剂及仪器

1.3.1 实验试剂 白细胞介素8(IL-8)、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附法试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司,货号分别为:SP10233、SP10179、SP10205);IKB激酶2(IKK2)一抗(上海研生实业有限公司,货号:YS-YK00174);磷酸化IKB激酶α(p-IKBα)一抗(法国Covalab公司,货号:pab11292);NF-κB一抗(美国abclonal公司,货号:A15694);MUC5ac一抗(英国Abbexa公司,货号:abx106178);辣根过氧化物酶二抗(上海李记生物科技有限公司,货号:AP31L343);脂多糖(LPS)(北京伊塔生物科技有限公司,货号:YT1319);吡咯烷二硫代甲酸铵(PDTC)(上海翌圣生物科技股份有限公司,货号:52202ES50);戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司,国药准字H31021725);二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白定量试剂盒(Pierce公司,货号:23225);苏木素-伊红(HE)试剂盒( 北京索莱宝科技有限公司,货号:G1120);磷酸盐缓冲液(PBS)(北京伊塔生物科技有限公司,货号:YT8386)。

1.3.2 实验仪器 PFT动物肺功能检测仪(美国DATA SCIENCES INTERNATIONAL公司),BK-1200全自动生化分析仪(山东BIOBASE公司),RT-6100酶标分析仪(雷杜生命科学股份有限公司),MAGICL6800全自动化学发光测定仪(南京基蛋生物科技股份有限公司),TDZ4-WS型低速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司),SLK-O3000-S LED数显圆周摇床(美国赛洛捷克公司),DYCP-31E型电泳仪(上海新诺仪器设备有限公司),RV 10 digital V旋转蒸发仪(德国IKA公司),B203LED生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模 于53只大鼠中随机抽取10只大鼠作为健康组进行对照,剩余43只大鼠根据文献[5]建立COPD模型:采用气管滴入LPS结合香烟(焦油含量:13 mg,烟碱含量:1.1 mg,每次10支)建模。将大鼠放置于80 cm×50 cm×40 cm的密闭箱内,于建模第1、14天在大鼠气管内滴入LPS 200 μg/200 μL,第2～13、15～60天,每天烟熏0.5 h进行建模。大鼠在出现食欲不振、持续腹泻后,随机抽取3只大鼠,处死后取肺组织进行HE染色,观察到大鼠支气管腔狭窄、肺泡壁断裂且有大量炎性细胞浸润视为建模成功。建模过程中无意外死亡,剩余40只大鼠运用数字随机表法分为模型组、中药组、抑制剂组、联合组,每组10只。

1.4.2 给药 中药组大鼠予益气活血化痰方32 g/kg灌胃,每日1次,连续给药28天;抑制剂组大鼠予腹腔注射100 mg/kg的IL-8/IKK/NF-κB/MUC5ac通路抑制剂PDTC,每日1次,连续给药28天;联合组予益气活血化痰方32 g/kg灌胃的同时腹腔注射PDTC 100 mg/kg,每日1次,连续给药28天;健康组、模型组正常饲养,不予干预。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 肺功能指标 1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后暴露气管,在气管软骨处做环形切口,接入三通管,并将该管与气管固定,采用动物肺功能检测仪测定用力肺活量(FVC)、呼气峰值流速(PEF)、第1 s用力呼气容积(FEV1)。

1.5.2 肺泡灌洗液炎症因子水平 将各组大鼠麻醉后,打开胸腔,将灌胃针头插入气管,运用0.9%氯化钠注射液冲洗肺部并收集肺泡灌洗液,酶联免疫吸附法检测肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α水平,将标准品进行稀释后加入酶标孔内,封孔孵育2 h,清洗后加入生物素化抗体工作液孵育1 h,清洗后加入10 μL酶结合物工作液孵育0.5 h,清洗后加入显色液,孵育20 min,加入终止液,混匀后检测450 nm处光密度(OD)值。

1.5.3 支气管平滑肌厚度 根据文献[6]测量支气管平滑肌厚度。运用Image-Pro Plus 6.0软件进行测量,实验步骤严格按照说明书进行。以单位长度的平滑肌层面积(WAsm/Pi,μm2/μm)表示平滑肌层厚度。

1.5.4 蛋白免疫印迹法(Wb)检测各组大鼠肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达 取各组大鼠肺组织,剪碎后研磨,裂解液裂解,离心后取上清,BCA法测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白于SDS缓冲液中,煮5 min后,进行电泳,后转入PVDF膜上,加入5%脱脂奶粉,封闭2 h,后加入IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac一抗(1∶200),孵育过夜,PBS清洗后,加入辣根过氧化物酶二抗(1∶1000),封闭2 h,后PBS清洗。采用增强化学发光法(ECL)检测蛋白表达。运用凝胶成像系统对蛋白条带进行分析。

1.5.5 HE染色观察各组大鼠肺组织病理形态 取各组大鼠肺组织,多聚甲醛固定,脱水,包埋,切片,二甲苯脱蜡,乙醇脱水后烘干,苏木精染色10 min,盐酸(1%)处理,伊红复染,乙醇脱水,封片后使用生物显微镜(×200)观察肺组织病理形态。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能水平比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组FVC、PEF、FEV1水平均降低(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组FVC、PEF、FEV1水平均升高(P<0.05);联合组FVC、PEF、FEV1水平均高于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间各项指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肺功能水平比较

2.2 各组大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均升高(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均降低(P<0.05);联合组肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均低于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间各项指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平比较

2.3 各组大鼠支气管平滑肌厚度比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组支气管平滑肌厚度均增加(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组支气管平滑肌厚度均降低(P<0.05);联合组支气管平滑肌厚度低于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间支气管平滑肌厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠支气管平滑肌厚度比较

2.4 各组大鼠肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表达均升高(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表达均降低(P<0.05);联合组肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表达均低于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间各项指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表4。

健康组 模型组 中药组 抑制剂组 联合组

表4 各组大鼠肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达比较

2.5 各组大鼠肺组织病理形态 健康组大鼠肺组织结构完整;模型组大鼠肺组织支气管腔狭窄,肺泡壁断裂,有大量炎性细胞浸润;中药组、抑制剂组肺泡的病理情况有较大改善,但仍有部分炎性细胞浸润;联合组仅存在肺泡壁比健康组稍薄的情况,支气管腔、肺泡腔大小、内部纤毛均恢复正常,炎性细胞浸润较少。见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理形态(HE,×200)

3 讨论

气道黏液高分泌状态与炎症因子联系密切,IL-8/MUC5ac通路具有调控炎症因子的作用,IL-8为该通路的上游因子,在疾病中,IL-8水平增加可刺激IKK2活化,活化的IKK2通过磷酸化IKBα激活NF-κB,进一步促进炎症发展,导致气道分泌MUC5ac增多,气道黏液的分泌增加,加速炎性反应,出现级联效应,最终形成COPD。另外,吸烟也是COPD产生的重要原因,吸烟会导致MUC5ac增多,气道黏液分泌增加,造成气道狭窄,肺功能降低。

近年来,中医逐渐成为治疗COPD的热点。中医学认为,COPD的病因是“痰”和“瘀”,同时也是致病因素。肺气虚,则痰湿内生,从而闭阻气道;肺主气,病邪久留不除,则肺气更加虚弱,进而导致气虚、气滞;气滞则血瘀,痰瘀互结,则肺脏虚衰[7]。此外,香烟烟雾的吸入也可损伤肺脏,这也是本病发病的一个重要诱发因素。香烟燃烧后的烟雾中会产生大量的有毒物质,结合现代医学研究的观点[8],认为香烟烟雾属于传统中医理论中“毒”的范畴。烟毒长期薰蒸肺脏,炼液为痰,使肺叶焦痿、肺气阴受损,出现咳嗽、咯痰、咯血等症状;烟尘等异物直接吸入,沉积于肺,耗损肺气、伤及肺阴,阻碍气机运行,久则瘀血内阻。从总体上看,其病位在肺,涉及脾、心、肾三脏。该病主要病因为水停痰凝,气虚气滞,痰瘀互结。治疗应以益气、活血、化痰为主。文中所用药方以南沙参、黄芪、桔梗、紫菀、杏仁、甘草、百合为基本方,方中南沙参、黄芪补元固气;桔梗、紫菀、杏仁温肺下气;甘草、百合益气补中,养阴润肺;法半夏行气化痰;水蛭可破血逐瘀;茯苓健脾利水渗湿。

有研究表明,沙参、黄芪、茯苓等成分可有效抑制患者机体的炎性反应,降低IL-8、IL-17、TNF-α等炎症因子水平,调节机体免疫功能[9];益气活血化痰中药可有效抑制IL-8、NF-κB p65等水平,进而抑制气道炎症并提升COPD患者肺功能及免疫功能[10]。此外,韩敏等[11]研究中发现,PDTC可通过抑制NF-κB核转位降低细胞内容物乳酸脱氢酶水平,提示PDTC可通过抑制NF-κB信号通路提升细胞存活比例,降低急性心肌梗死患者的心肌细胞凋亡程度,从而保护损伤的组织。Zhang Y等[12]研究发现,通过给酮症奶牛注射PDTC可有效降低其中性粒细胞中Toll样受体的表达水平,并抑制IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的合成与分泌,证实PDTC可有效抑制炎性反应发生,有较好的抗炎效果。以上提示益气、活血、化痰类方药能不同程度抑制各类肺病中的NF-κB、IL-8、TNF-α等炎症因子的释放,对COPD患者也有类似的治疗作用。本实验中的益气活血化痰方具有益气活血、化痰止咳的作用。而PDTC能够通过抑制NF-κB通路保护并修复损伤的肺组织,二者联合对于抑制COPD患者炎症效果更佳。本研究结果显示,益气活血化痰方可显著抑制大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平,减少气道黏液的分泌,改善肺组织病理变化,恢复肺功能;另外蛋白免疫印迹检测结果显示,益气活血化痰方还可抑制肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达,从而抑制IL-8/MUC5ac的异常活化,最终达到缓解和治疗COPD的目的。

目前对于COPD的治疗,主要从抑制气道重塑方面入手。气道重塑主要表现在气管平滑肌细胞异常增加,造成气管管腔狭窄,影响预后[13]。在COPD发病过程中,炎症因子释放增加,加重了气道黏膜的炎症状态,使得黏膜下的胶原沉积过多以及平滑肌细胞异常增加,气道平滑肌细胞增殖,使气道收缩强烈以及气道壁增厚,从而使气道狭窄,气流阻塞,形成COPD[14]。在COPD发生时,IL-8/MUC5ac通路高度活化,高表达的IL-8会促进MUC5ac活化,促进炎症发展,炎症刺激导致气管壁反复损伤,进而导致胶原增生、平滑肌增厚及瘢痕形成等,导致气管重塑[15]。PDTC可有效降低肺组织中IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达,进而抑制细胞外胶原增生,保护受损的气管内壁。本研究结果显示,经益气活血化痰方联合PDTC治疗后,大鼠支气管平滑肌厚度显著降低,这提示益气活血化痰方加PDTC可有效改善COPD的气道重塑,这可能是通过调控IL-8/MUC5ac通路活化,抑制炎性反应完成的。

综上所述,益气活血化痰方干预COPD模型大鼠可通过抑制IL-8/MUC5ac通路活化,抑制炎症反应,降低气管平滑肌厚度,抑制气道重塑,改善肺功能。