刘 佳，周亚梅，张潇丹，李佩纹，徐冬梅

（重庆化工职业学院，重庆 401220）

中医学包含着中华民族几千年的康养理念和实践经验，是中华文明的瑰宝，凝聚着中国人民和中华民族的博大智慧。习近平总书记强调，要遵循中医药发展规律、传承精华、守正创新，加快推进中医药现代化、产业化，坚持中西医并重，推动中医药和西医药相互补充、协调发展，推动中医药事业和产业高质量发展，推动中医药走向世界，充分发挥中医药防病治病的独特优势和作用，为建设健康中国、实现中华民族伟大复兴的中国梦贡献力量。从国家战略角度说明了中药研究的重要性。

多糖为中药有效成分之一，广泛存在于各种动、植物和微生物组织中[1]。研究发现，多糖具有抗癌、抗肿瘤、抗衰老、抗艾滋病、降血糖、降血脂、调节免疫等作用[2]。以糖为研究重点的工程被认为是继基因工程、蛋白质工程之后生物化学和分子生物学中最重要的研究领域。我国对中药多糖的研究范围涉及多糖的化学研究、药理学研究、治疗作用等，尤其在抗肿瘤方面成为一个新热点，将多糖与核酸和蛋白质并列为生命现象中三大重要的高分子化合物。牛膝（Achyranthes bidentata Blume） 为苋科多年生草本植物的干燥根，是中国药典收录的常用中药，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行等功效[3]，有怀牛膝和川牛膝之分。怀牛膝主要分布在河南、河北等地。川牛膝主要分布在四川、云南等地。怀牛膝是“四大怀药”之一，含有多种化学成分，包括皂苷、甾酮类、多糖类和多种微量元素[4]。怀牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides，ABP） 是其重要药效物质基础，在临床应用和保健品中具有很大的开发潜力。

常见的中药提取方法有传统热水浸提法、蒸汽爆破法、微波辅助提取法和超声辅助提取法等[5]。传统热水浸提法存在有效成分损失大、工序复杂、提取周期长、提取率低等缺点[6]。蒸汽爆破法需要高压蒸汽，操作复杂。微波射线穿透性极好，能充分保护有效成分，对热敏性成分的浸提极为有效[7]。相比超声提取来说，微波提取具有选择性好、操作简便、提取周期短、能耗低、提取率高等特点，故微波提取在药物成分提取中得到广泛应用。因此，采用微波提取法对ABP 进行提取，有望减少ABP 破坏和损失，提高ABP 得率。响应曲面法（Response surface methodology，RSM） 是通过多元二次回归方程来拟合自变量因素与响应值之间的函数关系，并利用软件进行统计分析试验结果，从而优化工艺参数的方法。目前已广泛应用于中药组分提取过程的优化中[1]。

为此，拟通过微波提取法提取ABP，并用相应面法优化微波提取工艺，确定各因素及其交互作用对ABP 得率的影响，找出整个区域上因素的最佳组合和提取率的最优值，得到最佳提取工艺条件，以提高ABP 得率。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

怀牛膝，产自河北安国市，祁澳中药饮片有限公司提供；苯酚（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司提供；葡萄糖（分析纯），天津市北辰方正试剂厂提供；浓硫酸（分析纯），河北省保定化学试剂厂提供；其余试剂均为分析纯。

722 型植物粉碎机、722 型分光光度计，上海青华科技仪器有限公司产品；AB204-N 型电子天平；SHZ-D 型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司产品；微波炉（LG）；水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 怀牛膝多糖的微波提取

怀牛膝，干燥粉碎，过60 目筛。分别称取1 g牛膝干粉，按照不同的料液比加蒸馏水溶解，在不同的微波条件下进行提取，然后将提取液真空抽滤、减压浓缩并定容至100 mL。

采用传统热水浸提法和超声辅助提取法做对比。称取0.5 g 牛膝牛粉末于1 支试管中，加入15 mL 蒸馏水（即按照最佳微波提取条件的按料液比1∶30（g∶mL），在超声功率为60 W，超声温度为40 ℃的条件下，超声时间30 min，得到超声提取液，定容后测其提取率。称取10 g 牛膝粉末溶解在300 mL水中（按料液比1∶30 mL/g），在80 ℃的水浴锅中浸提 8 h，得到怀牛膝的水煮提取液，测其得率。

1.2.2 多糖含量的测定及得率的计算

采用硫酸- 苯酚法测定怀牛膝可溶性总糖含量[8-9]。吸取100 μg/mL 葡萄糖标准溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 各补水至2.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL 和浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀，在室温下放置20 min，于波长490 nm 处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度C（mg/mL） 为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。

采用3,5 - 二硝基水杨酸比色法（DNS） 法测定多糖中还原糖的含量[8-9]。分别吸取10 mg/mL 的葡萄糖标准液1，2，3，4，5，6，7 mL 于10 mL 的比色管中，补蒸馏水至10 mL，即得质量浓度为1，2，3，4，5，6，7 mg/mL 的葡萄糖溶液。分别吸取上述葡萄糖溶液1 mL 于25 mL 的容量瓶中，加入3,5 -二硝基水杨酸溶液2 mL，置沸水浴中煮2 min 进行显色，然后用流水迅速冷却，用水定容到25 mL，摇匀，以试剂空白作参比，在最大吸收波长为540 nm处测其吸光度，并以质量浓度C（mg/mL） 为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘出标准曲线。

总糖及还原糖的含量计算方法如下公式计算：

含量（%）=

多糖含量=总糖含量- 还原糖含量[8-9].

1.2.3 单因素试验设计

研究微波提取功率、时间、料液比和提取次数等因素对ABP 提取的影响。通过因素分析，确定其条件范围。

1.2.4 响应面法分析试验

在单因素试验基础上，选择提取功率、提取时间、料液比及提取次数为自变量，以ABP 得率为响应值，采用Design Expert 统计分析软件的响应面法安排试验，根据中心组合（Box-behnken） 试验设计原理采用四因素三水平的响应面分析法，确定微波法提取ABP 的最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

采用硫酸- 苯酚法测定怀牛膝可溶性总糖含量的标准曲线为：

采用3,5 - 二硝基水杨酸比色法（DNS） 法测定多糖中还原糖的含量的标准曲线为：

标准曲线见图1。

图1 标准曲线

2.2 单因素试验

2.1.1 微波提取功率的影响

在料液比为1∶50，微波时间为2 min 条件下，提取1 次，比较不同微波功率ABP 得率的影响，选择最佳功率。

不同提取参数对ABP 得率的影响见图2。

图2 不同提取参数对ABP 得率的影响

由图2（a） 可知，随微波功率的增加，ABP 得率迅速增大。但当功率超过800 W 后，ABP 得率下降。这可能是因为随着提取功率的增加，提取率提高，但提取功率更大以后，产生的多糖会被降解和氧化。所以确定ABP 的最佳微波功率为800 W。微波提取功率对ABP 的提取率有显著的影响。

2.1.2 微波提取时间的影响

固定料液比为1∶50，提取功率为800 W，提取1 次，比较不同微波提取时间对ABP 得率的影响，选择最佳微波提取时间。由图2（b） 可知，随微波提取时间的增加，ABP 得率迅速增大。但超过2.5 min 后，ABP 得率下降。这可能是因为随着提取时间的增加，细胞被均匀破坏，并加速了ABP 在水中的释放和扩散。但提取时间更长以后，产生的ABP会被降解或氧化。所以确定ABP 的最佳提取时间为2.5 min。微波提取时间对ABP 的提取有显著影响。

2.1.3 料液比的影响

固定提取时间2.5 min 及功率800 W 条件下，选择料液比为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL） 各提取1 次，根据ABP 得率确定最佳料液比。由图2（c） 可知，随着料液比的增加，ABP 得率增大，但超过料液比超过1∶30（g∶mL） 之后，ABP 得率下降。这可能是因为较大的料液比中多糖从内部细胞扩散至外部溶剂的速率更快，料液比更大以后，附着在单位体积上的微波能量会降低，导致提取率降低。所以，确定提取ABP 的最佳料液比为1∶30（g∶mL）。

2.1.4 提取次数的影响

在固定上述各因素最佳条件下，测定提取1 次的ABP 得率，再将抽滤所得的沉淀全部转移至1 个烧杯中，重复以上操作。依次测得提取2，3 次样品中多糖含量，记录结果，得出最佳提取次数。由图2（d） 可知，随着提取次数的增加，ABP 得率增大，但当提取次数达到2 次之后，ABP 得率增加的趋势有所平缓。考虑到节约资源和能源，选择ABP 最佳提取次数为2 次。

2.2 响应面分析法试验

2.2.1 微波法提取牛膝多糖响应面试验设计因素水平及编码

微波法提取怀牛膝多糖响应面试验设计因素与水平设计见表1。

表1 微波法提取怀牛膝多糖响应面试验设计因素与水平设计

2.2.2 微波法提取牛膝多糖响应面试验设计及结果

微波法提取怀牛膝多糖响应面试验设计及结果见表2。

表2 微波法提取怀牛膝多糖响应面试验设计及结果

由表2 可知，利用Minitab 软件对表2 中的试验数据进行多元回归拟合，以A=(a-800)/200，B=(b-2.5)/0.5，C=(c-30)/10，D=(d-2)/1 为自变量，以多糖产率为响应值（Y），进行响应面分析试验。得到牛膝多糖提取率对编码自变量的二次多项式回归模型为：

Y=29.37-0.83A-0.18B+0.39C-0.31D-0.81AB+0.000AC+1.07AD+1.22BC-1.5BD-2.83CD-3.54A2-3.66B2-4.22C2-5.52D2.

对多元二次回归方程取一阶偏导得零，得到A=-0.127 8，B=0.013 1，C=0.068 1，D=-0.059 7 代入A=(a-800)/200，B=(b-2.5)/0.5，C=(c-30)/10，D=(d-2)/1，得a=774，b=2.5，c=31，d=2。为检验Boxbehnken 试验设计所得结果的可靠性，将上述优化出的工艺参数修正为微波功率800 W，提取时间2.5 min，料液比1∶30（g∶mL），提取次数2 次。回归方程的R2=0.869 3，相关系数R=0.932 3，说明模型响应值的变化93.23%来自所选参考变量。因此，回归方程可较好地描述因子与响应值之间的关系。

回归模型显著性检验及方差分析见表3。

表3 回归模型显著性检验及方差分析

由表3 可知，试验因子与响应值不是简单的线性关系。整体模型的p<0.01，表明该二次方程模型具有高度显著性，可以较好地描述各因素与响应值之间的关系，能够拟合真实的试验结果。各因素对多糖产率的影响是A>C>D>B，即功率影响最大，其次是料液比、提取次数、提取时间。

2.2.3 微波法提取牛膝糖响应曲面直观分析

微波功率、提取时间、料液比、提取次数对ABP 产率的交互影响曲面图见图3。

图3 提取功率、提取时间、料液比、提取次数对ABP 产率的交互影响曲面图

图3 是通过多元回归方程所做的响应曲面图及等高线图，所拟合的响应曲面及等高线图能比较直观地反映各因素和各因素间的交互作用。由图3 可知，6 个响应曲面均为开口向下的凸型曲面，同时等高线最小椭圆的中心在所选的范围内，说明响应值（牛膝多糖提取率） 在4 个因子设计的范围内存在最大值。比较几个图可以看出微波功率（A） 对响应值的影响比较大，表现为Y 值的变化比较大。图3（e） 表明B、D 的交互作用显著，在所选范围内，B取不同的编码值时D 对Y 的影响表现出不同的规律，同样D 取不同的编码值时B 对Y 的影响规律也呈一定的变化趋势。从单个因素对Y 值的影响来看，D的影响显著性要大于B。图3（f） 表明C、D 的交互作用最显著，在所选范围内，C 取不同的编码值时D对Y 的影响表现出不同的规律，同样D 取不同的编码值时C 对Y 的影响规律也呈一定的变化趋势。从单个因素对Y 值的影响来看，C 的影响显著性要大于D。由图3（a） 可以看出A 与B 的交互作用并不显著，它们对Y 值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有明显变化。同时也可以看出A 对Y 值影响的显著性要大于B。图3（b） ~ 3（d） 也表现出与图3（a） 相似的规律。综合各图，4 个因素对Y值的影响，以及各因素之间的交互影响与回归分析结果吻合。

2.2.4 验证试验

在响应面方法优化得到的最佳条件下对牛膝进行3 次平行微波提取试验，平均产率为29.40%，与理论预测值29.38%相比，相对误差为0.07%，验证值与回归方程所预测值相吻合得很好，验证了此模型的可行性。

2.3 提取方法对牛膝多糖产率的影响

拟合模型获得的试验结果与常规方法的试验结果比较见表4。

表4 拟合模型获得的试验结果与常规方法的试验结果比较

由表4 可知，ABP 产率为微波提取> 超声提取>热水浸提法，微波辅助提取远远优于常规热水浸提法，也明显优于超声辅助提取。这些结果表明微波提取怀牛膝多糖的优越性。

3 结论

在单因素试验的基础上，进行四因素三水平的Box-behnken 中心组合设计试验，采用多元二次回归模型对各项进行统计分析，得最优的条件为微波功率800 W，提取时间2.5 min，料液比为1∶30（g∶mL），提取次数为2 次，牛膝总多糖提取率的理论值为29.38%。按最优条件进行验证试验，牛膝多糖的产率为29.40%，与理论值的相对误差为0.07%，对工业提取牛膝多糖有一定的指导意义。试验结果表明，采用微波提取工艺提取牛膝中的多糖提取率优于超声提取法、常规热水浸提工艺，微波辅助法适用于提取ABP。